阿霉素人血白蛋白微球的制备及其工艺优化
作者：张艳秋，徐多多，潘志，高阳,高其品
【摘要】 目的：应用新型工艺制备阿霉素人血白蛋白微球(ADR?HAS?MS)，并优化其最佳制备工艺。方法：以阿霉素(ADR)、人血白蛋白(HAS)为材料，采用超声雾化?化学交联技术制备ADR?HAS?MS；并应用正交设计法确定其制备工艺。结果：所得微球光学显微镜观测呈球型,圆整,粒径分布范围为2～5 μm,平均粒径为2.165 μm,载药量、包封率分别为(3.174±0.137)，(75.11±3.127)。结论：本法工艺可实现连续地、批量化生产，既能满足化生产要求，又可保证产品批量间的稳定性，具有良好应用前景。
【关键词】 阿霉素人血白蛋白微球 制备工艺 正交设计
白蛋白微球(albumin microsphere)是由人或动物的白蛋白制成的粒径为微米级的球状物［1］。早期的白蛋白微球研究主要集中在放射医学领域,用于检查肺循环异常［2］。后来人们发现白蛋白微球不仅可生物降解,无毒性和抗原性，而且对亲水性药物有较高的负载能力，很适合用作药物载体，于是将其应用于药物制剂尤其是抗癌药物制剂的研究中［3?4］。本实验利用“白蛋白微球制备仪”，采用超声雾化?化学交联剂法制备肝靶向制剂ADR?HAS?MS，可通过控制粒径实现靶向性。以粒径及其分布、载药量、包封率等为考察指标, 在单因素考察的基础上，对影响ADR?HAS?MS制备的各个因素采用正交设计?多指标综合评价法对微球的制备工艺进行优化筛选，从而确定了其最佳处方工艺。
1 实验材料
1.1 试剂 20%人血白蛋白(哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司)；注射用盐酸多柔比星(ADR)(浙江海正药业股份有限公司);25%戊二醛(天津市光复精细化工研究所，分析纯)；氢氧化钠(北京化工厂)；磷酸二氢钾(汕头市西陇化工厂)；胰蛋白酶(1∶250，宝泰克)；十二烷基硫酸钠(北京鼎国生物技术有限责任公司)；冰醋酸(北京化工厂，分析纯)；色谱甲醇、色谱乙腈；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器 501型超级恒温器(上海实验仪器厂有限公司);JR?051型及JR?031型超声波投入式雾化器(北京东方金荣超声电器有限公司)；HH?1数显恒温水浴锅、85?2恒温定时磁力搅拌器(江苏省金坛市江南仪器厂)；A?3S水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)；XSP?BM生物显微镜(上海彼爱姆光学仪器制造有限公司)；LS?13320MW激光粒度分析仪(Beckman?Coulter)；KQ?100B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TL?5.0台式离心机(上海市离心机械研究所)；Waters 2487?600高效液相色谱仪。
2 实验方法
2.1 ADR?HAS?MS制备 超声雾化法是一种制备ADR?HAS?MS的新方法，在超级恒温器中加入丙酮溶媒,在50 W的超声雾化器中加入与阿霉素为一定质量比的某一浓度的白蛋白水溶液，超声雾化后，采用在1 500转磁力搅拌器下缓慢滴加一定浓度的戊二醛交联剂，固化搅拌60 min后，用蒸馏水反复离心洗涤，即得红色阿霉素白蛋白微球。
2.2 微球性质考察
2.2.1 形态、粒径及分布测定 光学显微镜下观察所制微球色泽、形态、圆整度、表面等；用激光粒度分析仪测定微球粒径大小及粒径分布。
2.2.2 浓度测定 利用计数板，采用白细胞计数法测定微球浓度。
2.2.3 载药量测定
2.2.3.1 标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的阿霉素标准品适量，用流动相作溶剂，制成浓度为1 mg/mL的标准贮备液。将其制成浓度为20、40、60、80、100、120 μg/mL的标准品溶液。采用高效液相色谱法，在254 nm处测定峰面积(A)，与浓度(C)做线性回归。
2.2.3.2 测定方法 酶解法降解ADR?HAS?MS溶液，取阿霉素?白蛋白微球混悬液加入酶解介质(内含0.1%胰蛋白酶的pH 7.4磷酸盐缓冲液),于37℃恒温水浴中温育，经裸眼观察混悬液完全转变为透明溶液，由显微镜验证所有微球完全消失，降解液过滤，取40 μL进样，记录高效液相色谱仪测得的峰面积，带入回归方程得到阿霉素浓度。载药量(%)=测得微球中药物重量/微球重量×100%［6］。
2.2.4 包封率测定 处理同2.2.3.2项下操作，测定微球中和丙酮溶剂介质中的药物含量［6］。
2.2.5 正交设计筛选最佳处方工艺 根据单因素考察结果(数据略)得出,化学固化剂戊二醛浓度(Glutaral)(A)、搅拌速率(Stir Rate简化为S.R)(B)、阿霉素与白蛋白质量比(ADR:HSA)(C)及白蛋白浓度(HSA/%)(D)是影响ADR?HAS?MS主要因素，按L9(34)进行正交设计,以粒径(R1)、载药量(R2)、包封率(R3)为考察指标，进一步筛选制备ADR?HAS?MS最优工艺［7］。
2.3 数据分析 用SPSS10.0进行综合评分。
3 结果
3.1 微球形态、粒径及分布结果 40倍光学显微镜下观察，微球均匀圆整，表面较光滑，分散性好；用激光粒度分析仪测定微球粒径分布范围为2～5 μm，平均粒径为2.165 μm，95%的微球粒径落在5 μm内。
3.2 微球浓度测定结果 3个批次微球数目，得微球浓度为(1.2～1.5)×1015个/L，即(1.2～1.5)×1012个/mL(n=3)。
3.3 载药量测定结果
3.3.1 ADR线性回归方程 根据实验数据及线性回归，得到C?A标准回归方程为C=25318A-3030.3(R2=0.9999，r=0.9999)，结果表明在20～120 μg/mL 范围内浓度与吸收度线性关系良好。
3.3.2 ADR回收率、精密度 经方法学考察，高、中、低3个浓度的平均回收率为99.57%，日内变异、日间变异系数均小于1%。
3.4 正交设计结果
3.4.1 正交设计因素水平表 见表1。
表1 正交设计因素水平表（略）
3.4.2 正交试验结果 见表2。
表2 正交试验结果（略）
3.5 Z值综合评价法分析结果 对实验结果进行直观分析，极差分析，确定影响因素的大小顺序是:C>D>B>A；最优处方：白蛋白浓度为5%，与阿霉素质量比为12.5∶1；化学交联剂戊二醛的浓度为0.25%，搅拌速率为1 500转。
4 小结
在微球的制备中，需要同时考察微球的粒径、载药量、包封率及外形等指标，以往的报道多是针对其中一个指标进行考察，往往单靠一个指标不能优选出兼顾多者的最佳工艺，本实验采用多指标综合评分法，不仅得到阿霉素白蛋白微球的最佳工艺，同时为其可能的化生产提供。
【参考文献】
［1］Kratz F,Fichtrer I,Schumarcher P,et al.Autitumor activity of acid labile transferring and albumin doxorbin conjugates in vitro and in vivo human tumor xerograft models［J］.Eur.J.Cancer,1997,33(8):175.
［2］邹东娜,张典瑞,杨海峰.白蛋白作为靶向给药载体的研究［J］.食品与药品,2007,9(1):54?57.
［3］王 恺,马光辉.白蛋白微球的制备、改性和应用的研究进展［J］.国外医学：药学分册,2003,30(6):366?371.
［4］Omelyanenko V,Kopeckova P,Geniry C,et al,Targetable HPMA copolymer adr?iamycin conjugates；recognition,internalization,and subcellular fate［J］.J control,Rel,1998,53(1?3):25?37.
［5］赵应征,鲁翠涛,梅兴国.常用多指标综合评价法在优选实验中的应用［J］.医学研究生学报,2004,17(7):624?626.
［6］崔福德.药剂学［M］.北京:人民卫生出版社,2005:380.
［7］徐希明.微球给药系统的工艺优化研究［J］.应用药学杂志,1999,16(3):1?4.
