急性脑缺血大鼠模型血瘀证舌象表现的评价方法及其与血液流变学的关系
作者：魏海峰, 亚白柳, 赵玲, 叶翠飞, 张丽, 李林
【关键词】 血瘀; 脑缺血; 再灌注; 血液流变学; 大鼠
Objective: To study the tongue tissue blood oxygen saturation measurement for evaluating tongue manifestation of blood stasis syndrome, and to explore its correlation with blood rheological disorder in a rat model of acute transient brain ischemia.
Methods: Twenty-eight SD rats were randomly divided into sham-operated group and ischemia group. Middle cerebral artery occlusion was induced by thread in rats of the ischemia group. Tongue tissue blood oxygen saturation, neurological severity score and the changes of blood viscosity, red blood cell deformity, thrombin time and fibrinogen in the rats were measured after 24-hour reperfusion.
Results: Blood viscosity and the content of fibrinogen in the ischemia group were significantly higher than those in the sham-operated group. Red blood cell deformity, thrombin time and tongue tissue blood oxygen saturation in the ischemia group were decreased as compared with the sham-operated group. There was a positive correlation between red blood cell deformity and tongue tissue blood oxygen saturation.
Conclusion: Tongue tissue blood oxygen saturation is a good measurement for evaluating blood stasis in a rat model of focal cerebral ischemia, and this model can be used as a rat model of stroke with blood stasis syndrome.
Keywords: blood stasis; brain ischemia; reperfusion; hemorheology; rats
理想的血瘀证动物模型对深入研究血瘀证生物学基础以及活血化瘀中药有重要意义［1］。以往评价动物模型的血瘀证表现主要通过血液流变学检测来实现，缺乏从模拟临床的宏观症状和体征等角度进行评价的手段。脑缺血再灌注大鼠模型常用来评价脑卒中药物的疗效，我们近期的研究发现该模型的全血黏度、红细胞聚集率和血浆纤维蛋白原含量明显增高。本研究拟借助一种可测量组织血氧饱和度的仪器测定该模型大鼠的舌血氧饱和度，从宏观角度评价血瘀证的舌象表现，并和血液流变学异常表现进行相关分析，评价该方法作为观察血瘀证动物舌象变化指标的合理性，并进一步验证急性脑缺血大鼠模型的血瘀证特征。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 聚乙烯吡咯烷酮，配制红细胞变形液，Sigma公司产品；10%水合氯醛，由首都医科大学宣武提供；栓线由北京沙东生物技术公司提供，使用前经0.1%多聚赖氨酸涂抹并在60 ℃下烤1 h［2］。
LBY-N6B全自动清洗血流变仪和微量血浆测试装置及LBY-BX3红细胞变形仪，均由北京普利生仪器有限公司提供；DL-4000B冷冻离心机，由上海安亭仪器厂生产；ViOptix公司发明的ODISseyTM局部组织血氧监护仪，由北京中沃科技有限公司提供。
1.2 动物及分组 28只SD大鼠，雄性，体质量（250±30）g，购于北京维通利华实验动物中心，合格证号SCXK（京）2002-003。在SPF级动物房适应性饲养16周后，相当于人类年龄的20～30岁［3］，体质量增加至450～600 g，随机分为假手术对照组和模型组，每组各14只。
1.3 造模方法 Longa等［4］方法制作局部缺血再灌注模型。用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞模型。大鼠以10%水合氯醛350～400 mg/kg腹腔注射麻醉，取颈前正中切口，分离结扎左侧颈外动脉和颈总动脉，并绕右侧颈总动脉结扎线远心端穿线备用；在右颈总动脉结扎处与右颈内动脉起始部之间切口，将尼龙栓线小心插入右侧颈内动脉约2 mm，即可闭塞左大脑中动脉。扎紧备用线以固定栓线，缝合皮肤，外留栓线10 mm。2 h后再次麻醉大鼠后剪开皮肤缝线，直视下轻轻拔出栓线约10 mm以实现再灌注。根据我们的预实验，450～500 g体质量大鼠的栓线头部直径为0.40～0.43 mm，500～550 g体质量大鼠的栓线头部直径为0.45～0.48 mm，550～600 g体质量大鼠的栓线头部直径为0.50～0.53 mm。假手术对照组参照上法暴露右侧颈总动脉后缝合关闭切口。
1.4 神经功能评分 模型组大鼠缺血2 h再灌注6 h及24 h后，按照改良的神经功能缺损评分法进行神经功能评分［5］。1～6分为轻度损伤；7～12分为中度损伤；13～18分为重度损伤。
1.5 舌体组织血氧饱和度 大鼠造模24 h后，以10%水合氯醛300～350 mg/kg腹腔注射麻醉，将舌体轻轻拉出，以组织血氧测量仪的探头固定于大鼠舌体中部，压力以刚好接触舌体为度，接触面积达80%以上为标准，记录当时的血氧饱和度值。
1.6 血液流变学 记录完舌体血氧饱和度后，将大鼠腹正中切口，取腹主动脉血，分别置于有枸椽酸钠或肝素抗凝的试管内，参考马红等［6］方法，用LBY-BX3红细胞变形仪测定红细胞变形指数，LBY-N6B全自动清洗血流变仪及微量血浆测试装置测定血液流变学全血黏度、血浆黏度和聚集能力等指标。
1.7 统计学方法 各组数据用x±s表示，采用单因素方差分析方法进行比较；血氧饱和度与血液流变学相关关系的分析，采用Pearson’s相关系数法。
2 结 果
2.1 神经功能评分 缺血再灌注24 h后，模型组大鼠有6只死亡，脑缺血大鼠模型存在典型的脑卒中表现。模型组大鼠在缺血再灌注6 h及24 h后，神经功能评分分别为（11.0±2.5）分和（11.3±2.8）分，结果表明脑缺血大鼠模型的神经功能均出现中、重度损伤。
2.2 舌体组织血氧饱和度 假手术对照组舌体组织血氧饱和度为（65.8±5.5）%，模型组缺血再灌注24 h后舌体组织血氧饱和度为（58.9±10.3）%，明显低于假手术对照组（P<0.05），说明脑缺血大鼠舌体组织含氧量减低。
2.3 血液流变学指标 假手术对照组大鼠全血高、中、低切黏度及血浆黏度分别为（4.95±0.89）mPa·s、（6.08±1.19）mPa·s、（9.46±1.52）mPa·s和（0.99±0.10）mPa·s；模型组大鼠缺血再灌注24 h后全血高、中、低切黏度及血浆黏度分别为（5.86±1.18）mPa·s、（7.19±1.64）mPa·s、（12.15±4.31）mPa·s和（1.09± 0.07）mPa·s。与假手术对照组相比，脑缺血大鼠模型的血黏度升高，其中模型组全血低切黏度和血浆黏度两项指标与假手术对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。假手术对照组的红细胞高、中、低切变形指数分别为（46.90±1.71）%、（45.25±1.81）%、（42.31±1.82）%；模型组缺血再灌注24 h后红细胞高、中、低切变形指数分别为（44.48±2.30）%、（42.75±2.34）%、（39.73±2.25）%。与假手术对照组相比，模型组大鼠在三个切变水平的变形能力均减低，差异有统计学意义（P<0.05）。假手术对照组的凝血酶时间为（20.19±0.85）s，血浆纤维蛋白原含量为（2.95±0.81）pg/L；与假手术对照组相比，模型组大鼠缺血再灌注24 h后凝血酶时间［（18.90±1.83）s］显著缩短（P<0.05），血浆纤维蛋白原含量［（4.28±0.29）pg/L］则显著升高（P<0.01），提示脑缺血模型大鼠可出现高凝血状态。
2.4 舌体组织血氧饱和度与红细胞变形指数的相关性 舌体组织血氧饱和度与红细胞高、中、低切变形指数的相关性系数分别为0.524、0.521和0.522，分析结果发现红细胞变形指数与舌体组织血氧饱和度具有显著相关性（P<0.05），且呈正性相关关系。
3 讨 论
本课题组发现急性脑卒中大鼠全血黏度、红细胞聚集率及血浆纤维蛋白原含量增高，提出以脑缺血模型大鼠作为急性脑卒中血瘀证病证结合模型的观点。本研究发现急性脑缺血大鼠可表现为红细胞变性指数减低，凝血酶时间延长，舌体组织血氧饱和度降低，并与红细胞变性指数有良好的相关性，进一步证明脑缺血血瘀证动物模型可以作为脑卒中血瘀证动物模型，更重要的是首次报告了用舌体组织血氧饱和度来评价血瘀证“舌暗”表现的方法。
以往血瘀证动物模型的制备方法往往根据中医对血瘀证“血行不畅、壅遏经脉”的描述，通过冰水刺激和白蛋白注射等方法造成动物血液流动障碍，以血液流变学异常作为评价指标。然而中医学对血瘀证的认识建立在宏观描述的基础上，往往需结合患者主诉以及舌暗、脉涩等体征来诊断。如何给动物建立可靠的血瘀证宏观评价方法是多年困扰血瘀证基础研究的问题。
根据医学知识，舌暗是血液循环障碍在舌部组织的表现。血液循环障碍，则携氧能力降低，氧合血红蛋白减少，血液颜色变暗。舌的解剖结构特殊，分黏膜层、固有层和肌层。舌黏膜层较薄，一般情况下透明，固有层和肌层富有血管。因此，通过望舌可较容易地观察到周身血液循环状态，中医学通过舌诊观察血循环状态有切实的根据。
舌暗是血瘀证的重要证候表现，也是临床医生诊断血瘀证最常用的依据之一。医生主要根据目测结果再结合经验进行评价，但是科学研究要求客观的评价方法。有人尝试将患者或动物的舌象进行拍照记录，然后根据颜色深度进行比较分析。但是由于摄影受到光照等条件的影响，容易造成偏差，而且由于色彩的分析通常是根据红、黄、蓝三种色素进行调配，但是这三种色素得到的是三个变量而非一个变量，不便于量化进行组间比较。
该研究所用ODISseyTM组织氧含量测定仪是根据携氧和非携氧血红蛋白对特定波长的近红外光吸收程度不同的原理研制的设备。它采用双波长近红外线和每个探头4个接收通道来测量光线散射和吸收，通过测算组织中携氧和非携氧血红蛋白的比例来评价组织中的血氧含量，可以通过探头直接出每一立方厘米组织中的氧饱和度［7］。这样解决了以往激光多普勒等设备只能测定组织表面血循环，对组织内部含氧情况不能测定的问题。研究表明该设备测量值与离体和在体的血气分析有98%的相关性［8］。
我们的研究表明，脑缺血大鼠舌体的血氧饱和度与血液红细胞变形性有密切关系。红细胞变形性是评价红细胞状态的重要指标，局部或周身血液黏度等理化条件改变时，红细胞的膜结构容易破坏，血红蛋白结合氧的能力也降低［9］，从而使血液颜色变暗。舌体黏膜较薄，微循环的改变容易被观察到，也容易被血氧饱和度仪器检测。因此，舌体组织血氧饱和度测定是评价血瘀证舌暗的有效方法。
【】
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