独活中6种香豆素类成分在Caco?2细胞单层模型中的吸收转运研究
【摘要】 目的：研究独活中6种香豆素类成分（伞形花内酯、甲氧基欧芹素、二氢欧山芹素、二氢欧山芹醇乙酯、当归醇?A和当归醇?B）在人源结肠腺癌细胞系Caco?2细胞单层模型的吸收和转运。方法：采用Caco?2细胞单层模型研究6种香豆素类化合物由绒毛面（AP侧）到基底面（BL侧）和从BL侧到AP侧两个方向的转运过程，采用高效液相色谱法测定其在AP和BL侧的含量，表观渗透系数（apparent permeability coefficient, Papp），并与阳性对照药普萘洛尔和阿替洛尔进行比较。采用ATP耗竭剂碘乙酰胺和MRP2抑制剂MK571添加法探讨当归醇?B的转运机制。结果：6种香豆素类成分皆以被动扩散为主要方式被Caco?2细胞吸收、转运。伞形花内酯、甲氧基欧芹素、二氢欧山芹素、二氢欧山芹醇乙酯、当归醇?A和当归醇?B由AP侧到BL侧的Papp分别为（2.679±0.263）× 10?5、（1.306±0.324）×10?5、（0.595±0.086）×10?6、（0.293±0.041）×10?6、（1.532±0.444）× 10?5和（1.413±0.243）×10?5 cm/s；由BL侧到AP侧的Papp分别为（3.381±0.410）×10?5、（0.898±0.134） × 10?5、（0.510±0.183）×10?6、（0.222±0.025）×10?6、（1.203±0.280）×10?5和（0.754±0.092）×10?5 cm/s。在本实验条件下，易吸收的阳性对照药普萘洛尔由AP侧到BL侧的Papp值为2.18×10?5 cm/s，不易吸收的阳性对照药阿替洛尔由AP侧到BL侧的Papp值为2.77×10?7 cm/s。上述6个香豆素类化合物中，伞形花内酯、甲氧基欧芹素、当归醇?A和当归醇?B的Papp值与普萘洛尔的Papp值在一个数量级；二氢欧山芹素和二氢欧山芹醇乙酯的Papp值在易吸收和不易吸收的阳性对照药之间。以EBSS代替HBSS作为转运介质，在碘乙酰胺和MK571存在下，当归醇?B从AP侧到BL侧和从BL侧到AP侧转运的Papp值与HBSS为转运介质的对照组相比皆没有统计学意义上的变化。回收率实验中，伞形花内酯的平均总回收率为（83.31±3.52）%、当归醇?A的平均总回收率为（77.39±7.38）%；甲氧基欧芹素、二氢欧山芹素和当归醇?B的平均总回收率在50%～65%之间，二氢欧山芹醇乙酯的平均总回收率低于10%。甲氧基欧芹素和二氢欧山芹素在Caco?2细胞中的蓄积率分别为（36.15±5.87）%和（53.90±4.39）%。结论：6种香豆素皆以被动扩散为主要方式被Caco?2细胞单层吸收和转运；伞形花内酯、甲氧基欧芹素、当归醇?A和当归醇?B是良好吸收的化合物，二氢欧山芹素和二氢欧山芹醇乙酯的吸收性属中等。在Caco?2细胞中，甲氧基欧芹素和二氢欧山芹素有蓄积，二氢欧山芹醇乙酯具有代谢不稳定性。当归醇?B的转运不受转运介质EBSS（pH 6.5）的影响，碘乙酰胺或MK571的存在亦不影响当归醇?B在两个方向的转运。
【关键词】 Caco?2细胞; 香豆素类; 肠吸收; 表观渗透系数
Objective: To study the absorption and transepithelial transport of six coumarins (umbelliferone, osthole, columbianadin, columbianetin acetate, angelol?A and angelol?B, isolated from the roots of Angelica pubescens f. biserrata) in the human Caco?2 cell monolayer model.Methods: The in vitro cultured human colon carcinoma cell line, Caco?2 cell monolayer model, was applied to study the absorption and transport of the six coumarins from apical (AP) to basolateral (BL) side and from BL to AP side. The six coumarins were measured by reversed?phase high?performance liquid chromatography (HPLC) coupled with ultraviolet absorption detector. Transport parameters and apparent permeability coefficients (Papp) were calculated and compared with those of propranolol as a control substance of high permeability and atenolol as a control substance of poor permeability. The transport mechanism of angelol?B was assayed by using iodoacetamide as a reference standard to inhibit ATP?dependent transport and MK571 as a well?known inhibitor of MRP2.Results: The absorption and transport of six coumarins were passive diffusion as the dominating process. The Papp values of umbelliferone, osthole, columbianadin, columbianetin acetate, angelol?A and angelol?B from AP to BL side were (2.679±0.263)×10?5, (1.306±0.324)×10?5, (0.595±0.086)×10?6, (2.930±0.410)×10?6, (1.532±0.444)×10?5 and (1.413±0.243)×10?5 cm/s, and from BL to AP side were (3.381±0.410)×10?5, (0.898±0.134)×10?5, (0.510±0.183)×10?6, (0.222±0.025)×10?6, (1.203±0.280)×10?5 and (0.754±0.092)×10?5 cm/s, respectively. In this assay, the Papp value of propranolol was 2.18×10?5 cm/s and the Papp value of atenolol was 2.77×10?7 cm/s. Among the 6 coumarins, the Papp values of umbelliferone, osthole, angelol?A and angelol?B from AP to BL side were identical with that of propranolol, and columbianadin and columbianetin acetate lied between propranolol and atenolol. When replaced the HBSS with EBSS, and iodoacetamide or MK?591 were used in the experiment, the Papp of angelol?B had no statistical difference as compared with the control group. In the mean total recoveries, umbelliferone was (83.31±3.52) %, angelol?A was (77.39±7.38) %, osthole, columbianadin and angelol?B were between 50% to 65%, and columbianetin acetate was lower than 10%. The accumulation rates of osthole and columbianadin in the Caco?2 cells were (36.15±5.87) % and (53.90±4.39) %, respectively.Conclusion: The absorption and transport of umbelliferone, osthole, columbianadin, columbianetin acetate, angelol?A and angelol?B are passive diffusion as the dominating process in Caco?2 cell monolayer model. Umbelliferone, osthole, angelol?A and angelol?B are estimated to be highly absorbed compounds, and columbianadin and columbianetin acetate are estimated to be moderately absorbed compounds. In the Caco?2 cells, osthol and columbianadin appear to accumulate, and columbianetin acetate may be metabolited. The absorption and transport of angelol?B are not influenced by the change of pH and the presence of iodoacetamide or MK571.
Keywords: Caco?2 cell; coumarins; intestinal absorption; apparent permeability coefficient
独活为《药典》2005年版（第一部）收载的正品中药［1］，为伞形科（Umbelliferae）当归属（Angelica L.）植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim. f. biserrata Shan et Yuan 的干燥根。前期研究［2］我们报道了独活中香豆素类化学成分的鉴定，这些成分多具有镇痛、抗炎、抑制血小板聚集和实验性血栓形成、拮抗钙通道阻滞剂受体等生物学活性［3］。其中，甲氧基欧芹素抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖，主要作用在细胞周期的G1期，通过增加cAMP水平而发挥作用［4］。在离体抗肿瘤生物活性筛选试验中，伞形花内酯和二氢欧山芹素对人膀胱癌细胞［5］、二氢欧山芹醇乙酯对人鼻咽癌细胞株KB细胞［6］和人肝癌细胞株BEL?7402细胞［7］等的生长具有抑制作用。人源结肠腺癌细胞系Caco?2细胞单层体外培养模型目前正被广泛应用于合成药物吸收转运研究。为了考察独活中香豆素类化学成分在整体口服实验中能否被吸收和吸收程度，本文首先采用Caco?2细胞单层模型［8］研究独活中的主要化学成分伞形花内酯（umbelliferone）、甲氧基欧芹素（osthole）、二氢欧山芹素（columbianadin）、二氢欧山芹醇乙酯（columbianetin acetate）、当归醇?A（angelol?A）和当归醇?B（angelol?B）的吸收和转运。6种香豆素类成分的化学结构见图1。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株
Caco?2细胞株（ATCC #HTB?37）购自美国ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)。
1.1.2 主要试剂
实验中使用的试剂见前期报道［8］。6种香豆素来源于传统中药独活，其提取、分离、纯化和结构鉴定见前期报道［2］。
1.1.3 主要仪器
实验中使用的仪器见前期报道［8］。Varian 高效液相色谱（high performance liquid chromatogram, HPLC）系统：Varian ProStar 230 型泵，Varian ProStar 330 PDA 检测器，Varian Star 色谱工作站，Version 4.5软件。DiamonsilTM C18 色谱柱 (250 × 4.6 mm i.d.; 5 μm)，联有Dikma Easy C18 保护柱 (20 × 4.6 mm i.d.)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养条件
按“Caco?2细胞模型和标准操作规程”［8］培养Caco?2细胞，本实验所用细胞代数在50～62代。主要步骤为Caco?2细胞接种密度为6.25×104 个/孔；培养19～21 d细胞完全汇合并分化；跨上皮细胞电阻大于600 Ω/cm2。本实验易透过Caco?2细胞单层阳性对照药物普萘洛尔的表观渗透系数（apparent permeability coefficient, Papp）值为2.18×10?5 cm/s，不易透过Caco?2细胞单层阳性对照药物阿替洛尔的Papp值为2.77×10?7 cm/s，证明Caco?2细胞单层有足够的紧密性和完整性，模型符合转运实验要求［8］。
1.2.2 受试6种香豆素溶液的配制
分别精密称取适量6种香豆素类成分，定溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）中，配制成储备液。以Hank's平衡盐缓冲液（Hank's banlanced salt solution, HBSS, pH 7.4）稀释为25、50和100 μmol/L，转运试验中DMSO终浓度低于2%（细胞毒试验结果表明DMSO在该浓度下对Caco?2细胞单层无影响）。
1.2.3 转运实验
取细胞生长形态良好的Caco?2细胞的转运（transwell）板置于恒温水浴摇床（37 ℃，55 r/min）上，用37 ℃ HBSS洗涤顶端（apical side, AP侧）和底端（basolateral side, BL侧）各3次，最后一次洗涤后在水浴上恒速摇动30 min，测定跨上皮细胞电阻，符合要求者进行下一步实验。然后，吸走AP侧和BL侧的HBSS，根据实验设计，分别在AP侧和BL侧加入受试香豆素溶液和HBSS溶液。吸收转运实验为从AP侧到BL侧转运，将香豆素溶液0.5 ml加到AP侧（给予端），同时BL侧加入1.5 ml HBSS（接收端）；外流实验为从BL侧到AP侧转运，将香豆素溶液1.5 ml加到BL侧（给予端），同时AP侧加入0.5 ml HBSS（接收端）。然后，将transwell板于恒温摇床（37℃, 55 r/min）上恒速孵育，按实验设计的时间点收集BL侧或AP侧的溶液，单孔取点，每点平行3孔。将收集的溶液在－20 ℃条件下冷冻后放置于冷冻干燥机中干燥，备用，供HPLC分析。
1.2.4 细胞摄入（蓄积）实验
转运实验结束后，将移去测试液的Caco?2细胞单层用冰冷的HBSS洗涤一次，然后加入300 μl甲醇，37 ℃孵育30 min，提取蓄积在Caco?2细胞中的香豆素（包括特异性和非特异性结合的），用HPLC法定量测定蓄积在Caco?2细胞中的香豆素。
1.2.5 当归醇
B在Earle's平衡盐缓冲液、碘乙酰胺和MK571存在下的转运实验 HBSS的pH为7.4，Earle's平衡盐缓冲液（Earle's banlanced salt solution, EBSS）的pH为6.5，探讨pH对当归醇?B吸收转运的影响。碘乙酰胺为三磷酸腺苷耗竭剂，MK571为多药耐药蛋白2（multidrug resistance protein 2, MRP2）抑制剂，探讨抑制剂对当归醇?B吸收转运的影响。具体方法是以EBSS作为转运介质代替HBSS稀释当归醇?B进行转运实验。取一定量的1 mol/L碘乙酰胺和一定量的10 mmol/L当归醇?B混合均匀，用EBSS转运介质稀释成测试体系中碘乙酰胺为5 mmol/L和当归醇?B为50 μmol/L；在MK571抑制剂实验中，取一定量的10 mmol/L MK571和一定量的10 mmol/L当归醇?B混合，以EBSS稀释至测试体系中MK571和当归醇?B皆为50 μmol/L。转运实验步骤同上。
1.2.6 分析样品的处理及其HPLC分析条件
在转运实验中得到的冻干样品中加入等体积的甲醇，置超声水浴中超声20 min，以充分溶解样品。在15 000 r/min条件下离心10 min，上清液即为分析样品溶液。取分析样品溶液或Caco?2细胞膜甲醇提取液20 μl（蓄积实验），注入HPLC系统，进行定量分析。根据预实验决定HPLC定量分析条件：伞形花内酯流动相为甲醇∶水（75∶25），检测波长为320 nm；甲氧基欧芹素流动相为甲醇∶水（85∶15），检测波长为330 nm；二氢欧山芹素和二氢欧山芹醇乙酯流动相皆为甲醇∶水（90∶10），检测波长皆为330 nm；当归醇?A和当归醇?B流动相皆为甲醇∶水（80∶20），检测波长皆为327 nm。在6种香豆素类成分分析中，流动相的流速皆为1 ml/min，柱温为室温，进样量为20 μl。用峰面积与各受试香豆素相应的工作曲线进行定量分析。
1.2.7 Papp值的计算和数据处理
6个香豆素类成分在Caco?2细胞单层模型中的Papp值按下式计算：Papp=dQ/dt×1/A×1/C0。Papp单位为cm/s。式中，Q是积累转运量（cumulative amount of transport），代表化合物在接收端出现的总量，单位为μmol，dQ/dt是渗透速率，单位为μmol/s；C0是化合物在给予端的初始浓度，单位为μmol/cm3；A是聚碳酯膜的表面积，单位为cm2。
1.3 统计学方法
所有数据处理用Microsoft Excel 2000（Microsoft, Redmond, WA, USA）进行，计量资料用x±s表示。各组组间差异采用单因素方差分析，采用Student Newman Keuls (SNK)进行组间的两两比较，以P<0.05作为具有统计学意义的标准。
2 结 果
2.1 定量分析方法的建立
将转运实验项前2次洗涤细胞的HBSS弃之，第3次洗涤细胞的HBSS与Caco?2细胞孵育（37 ℃，55 r/min）30 min，吸出，冷冻干燥，加入等量甲醇，漩涡混匀后超声溶解20 min，再在3 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，得滤液。用该滤液稀释各受试香豆素储备液，制作工作曲线。回归方程和线性范围分别为：伞形花内酯y=0.002 8x+ 0.061 (r=0.999 8)，(1.00～2.00)×10?2 nmol/L；甲氧基欧芹素y=0.002 6x+0.020 6 (r=0.999 5)，(1.00～2.00)×10?2 nmol/L；二氢欧山芹素y=0.002 2x+0.021 5 (r=0.999 1)，(1.00～2.00)×10?2 nmol/L；二氢欧山芹醇乙酯y=0.001 6x+ 0.001 6 (r=0.999 9)，(1.00～2.00)×10?2 nmol/L；当归醇?A y=0.002 7x+ 0.025 4 (r=0.999 4)，(1.00～2.00)×10?2 nmol/L；当归醇?B y=0.002 1x+0.022 (r=0.999 7)，(1.00～2.00)×10?2 nmol/L。
2.2 转运实验结果
随着浓度的增加，6种香豆素类成分的转运速率呈现类似的线性增加，无饱和趋势。随着浓度的增加，6种香豆素类成分Papp值变化不大，差别无统计学意义。当归醇?B跨细胞单层转运的时间动力学曲线显示，随着温育时间的延长，从AP侧到BL侧的转运百分数近似线性增加。见图2～4和表1。表1 6种香豆素成分在不同浓度时双向转运的表观渗透系数（略）
2.3 当归醇?B在EBSS、碘乙酰胺和MK571存在下的转运
在以EBSS代替HBSS作为转运介质、碘乙酰胺和MK571存在下的实验中，与HBSS为转运介质的对照组相比，当归醇?B从AP侧到BL侧和从BL侧到AP侧转运的Papp值皆没有统计学意义上的变化。见图5。
2.4 6种香豆素在Caco?2细胞的蓄积率和原型化合物的回收率
转运实验90 min后，6种香豆素类成分的平均总回收率（AP侧、BL侧和Caco?2细胞内蓄积的总和占转运初始时原型化合物总量的百分率）和细胞内蓄积率。结果见表1。
3 讨 论
应用人源结肠腺癌细胞系Caco?2细胞单层模型研究6个香豆素类化合物从两个方向（AP侧到BL侧和BL侧到AP侧）的吸收转运，实验结果表明，随着浓度的增加，它们的转运速率呈线性增加。选择Papp AP → BL/Papp BL → AP比值较大的当归醇?B绘制时间?转运率动力学曲线（图4），提示随着温育时间的延长，转运率呈线性增加，表明这6个化合物主要是通过被动扩散吸收转运。但是，6个香豆素类化合物吸收程度不同，从表1结果可知，伞形花内酯、甲氧基欧芹素、当归醇?A和当归醇?B的Papp值与易吸收的阳性对照药普萘洛尔的Papp值（2.18 × 10?5 cm/s）在同一个数量级，判断它们为吸收良好的化合物，推断其吸收率为70%～ 100%［9］。其中，对甲氧基欧芹素的推论与家兔口服甲氧基欧芹素的生物利用度为100%的实验结果［10］一致。二氢欧山芹素和二氢欧山芹醇乙酯的Papp值在对照药普萘洛尔和阿替洛尔的Papp值（2.77 × 10?7 cm/s）之间，判断它们为吸收中等的化合物，推断其吸收率为20%～70%［9］。为了探讨转运介质溶液pH对转运效果的影响，以pH 6.5的EBSS代替标准操作规程［8］中的pH 7.4的HBSS进行当归醇?B的转运实验，从AP侧到BL侧的Papp AP→BL值和从BL侧到AP侧的Papp BL→AP值皆没有统计学意义上的变化，提示其转运不受pH的影响［11］。在转运机制探讨方面，已知烷基化试剂碘乙酰胺具有抑制能量代谢并且耗竭细胞内储存的ATP的作用［12］，在Caco?2细胞单层用5 mmol/L的碘乙酰胺处理实验中，当归醇?B在两个方向的转运皆未受到影响，提示其转运不需要消耗能量。已知MK571抑制由MRP2介导的药物外排作用［8］，进行了MRP2抑制剂MK571对当归醇?B转运影响的实验。由图5可见，在MK571存在下，当归醇?B从BL侧到AP侧的转运与对照组相比差异没有统计学意义，提示当归醇?B在转运过程中不存在MRP2的介导作用。这些结果进一步证明了当归醇?B在Caco?2细胞单层模型的吸收转运是通过被动扩散机制进行的。此结果可以类推到其他5种香豆素的吸收转运机制。这一推论还基于以下事实： 6个香豆素的Papp AP→BL/Papp BL→AP比值皆接近1。实际上，在Caco?2?transwell 系统中，转运过程中的两个方向的浓度梯度改变并不是完全对等的，因此，在被动扩散转运过程中从AP侧到BL侧的Papp值大于从BL侧到AP侧的Papp值，这样的差别是由于Caco?2细胞单层AP侧分化出绒毛，其褶皱总面积大大高于BL侧面积［13］，这使得Caco?2细胞单层AP侧具有更大的吸收面积。从浓度对转运速率影响的曲线中可以看到随着浓度的增加，6个香豆素的转运速率线性增加，没有出现饱和现象，且每个香豆素的Papp值随着浓度的增加变化不大。提示本研究中受试香豆素的转运主要是靠浓度驱动的被动扩散。
在细胞中蓄积和回收率实验中，从表1结果可知伞形花内酯、二氢欧山芹醇乙酯、当归醇?A和当归醇?B在Caco?2细胞中的蓄积非常少，小于6.51%；甲氧基欧芹素和二氢欧山芹素在Caco?2细胞中有一定的蓄积，分别为36.15%和53.90%，这可能与其结构有关。6个香豆素类化合物中，平均总回收率只有伞形花内酯超过了80%，这与其分子结构“刚性”较强有关；当归醇?A的平均总回收率接近80%；甲氧基欧芹素、二氢欧山芹素和当归醇?B在50%～65%之间，而二氢欧山芹醇乙酯低于10%，提示香豆素类化合物侧链酰基部分的当归酰基（二氢欧山芹素和当归醇?A）和巴豆酰基（当归醇?B）在Caco?2细胞中的代谢稳定性要高于乙酰基（二氢欧山芹醇乙酯），总的趋势是酰基在Caco?2细胞中的代谢稳定性差。二氢欧山芹醇乙酯可能在Caco?2细胞中代谢为二氢欧山芹醇，有待今后进一步研究。本文研究结果为研究独活中总香豆素成分在Caco?2细胞单层吸收转运模型中的相互作用和它们的生物利用度奠定了基础。
【】
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