补肾化瘀祛痰方对雄激素致不孕大鼠卵巢局部调控因子的影响
【摘要】 目的：观察补肾化瘀祛痰方（Bushen Huayu Qutan Recipe, BHQR）对雄激素致不孕大鼠（androgen?sterilized rat, ASR）卵巢局部调控因子的影响。方法：选择9日龄幼年SD雌性大鼠105只，随机分为病理模型组（90只）和溶媒对照组（15只），丙酸睾丸酮诱导形成ASR。造模成功的30只大鼠随机分为中药干预组和模型对照组。中药干预组用BHQR灌胃干预，模型对照组及溶媒对照组给予蒸馏水灌胃处理，疗程30 d。疗程结束后观察大鼠性周期情况，用放射免疫方法检测血睾酮和胰岛素（insulin, INS）含量，用免疫组织化学方法检测卵巢组织抑制素（inhibin, INH）、胰岛素样生长因子?Ⅰ(insulin?like growth factor?Ⅰ, IGF?Ⅰ)和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表达。结果：BHQR不仅能明显降低大鼠血INS水平（P<0.05），还能显著降低INH、IGF?Ⅰ和VEGF在卵巢局部的表达（P<0.01）。大鼠排卵恢复率为66.67％。结论：BHQR可能通过改善胰岛素抵抗，降低INH、IGF?Ⅰ及VEGF水平，改善卵巢内部环境，多途径、多靶点促使卵巢功能恢复，促进卵泡生长发育，诱发排卵。
【关键词】 补肾化瘀祛痰方; 不育; 抑制素类; 胰岛素样生长因子Ⅰ; 血管内皮生长因子类; 大鼠
Objective: To explore the effects of Bushen Huayu Qutan Recipe (BHQR), a compound traditional Chinese herbal medicine, on local ovarian factors in androgen?sterilized rats (ASR).Methods: One hundred and five 9?day?old SD rats were randomly divided into normal control group (15 rats) and ASR group (90 rats). ASR was induced by subcutaneous injection of testosterone propionate, and the rat model of ASR was established successfully in 30 rats in the ASR group. Thirty ASR rats were randomly divided into untreated group and BHQR?treated group. There were 15 rats in each group. The rats in BHQR?treated group were intragastrically administered with BHQR. The rats in the normal control and untreated groups were intragastrically administered with distilled water. They were all treated for 30 days. The levels of serum testosterone and insulin (INS) were measured by radioimmunoassay. The inhibin (INH) level, and the expressions of insulin?like growth factor?Ⅰ(IGF?Ⅰ) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in ovary were determined by immunohistochemical method.Results: None of the ASR ovulated and all the rats in the normal control group ovulated. The rate of ovulation in BHQR?treated group was 66.67%. The serum concentrations of testosterone and INS in the untreated group were significantly higher than those in the normal control group (P<0.05), and the serum concentrations of testosterone and INS in BHQR?treated group were decreased as compared with the untreated group (P<0.05). The levels of ovarian INH, IGF?Ⅰand VEGF in the untreated group were significantly higher than those in the normal control group (P<0.01), and the levels of ovarian INH, IGF?Ⅰand VEGF in BHQR?treated group were decreased as compared with the untreated group (P<0.01).
Conclusion: BHQR is an effective recipe in promoting ovulation, and the effects of BHQR on balancing the internal environment of ovary may be due to the reduction of serum INS level and decrease in the expressions of ovarian INH, IGF?Ⅰand VEGF.
Keywords: Bushen Huayu Qutan Recipe; infertility; inhibins; insulin?like growth factorⅠ; vascular endothelial growth factors; rats
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS），又称Stein?Leventhal综合征，是一种发病多因性、临床表现多态性疾病，以长期无排卵和持续高雄激素为主要特征［1］。目前关于PCOS的发病机制学说众多，但确切病因仍不明确，且缺乏理想的方法。西医主要有手术和药物等治疗方法，但由于手术创伤较大，而西药长期服用毒副作用较大，故临床应用受到一定的限制。中医古籍并无PCOS这一病名，根据临床表现，应归属于月经后期、闭经和不孕症等范畴，目前中医在治疗PCOS方面已显示一定优势。补肾化瘀祛痰方（Bushen Huayu Qutan Recipe, BHQR）是临床的治疗PCOS的有效方剂［2］，本研究拟从血睾酮、胰岛素（insulin, INS）、卵巢局部调节因子抑制素（inhibin, INH）、胰岛素样生长因子?Ⅰ（insulin?like growth factor?Ⅰ, IGF?Ⅰ）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）着手进一步研究BHQR对其的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
32只3月龄雌性成年SD大鼠和8只3月龄雄性成年SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（沪）2003?0003，由第二军医大学长海动物中心饲养。将32只雌性成年SD大鼠和8只雄性成年SD大鼠，按4∶1合笼，交配后根据阴栓估计分娩日期，常规大鼠颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水，分娩8 d后选出雌性幼鼠105只供实验用，21 d断乳。25 ℃恒温（50%湿度），清洁级饲养，不加饲维生素类制品。12 h光照（6:00～18:00）和12 h黑暗（18:00～6:00）周期交替进行。
1.2 药物与试剂
丙酸睾丸酮注射液、中性茶油（上海通用药业股份有限公司，批号为050503）；BHQR（当归15 g，赤白芍各10 g，桑椹20 g，枸杞子20 g，瓦楞子15 g，制首乌18 g，麦冬12 g等）由第二军医大学长海医院中药房提供，自制成浓度相当于含生药2.56 g/ml的溶液；大鼠胰岛素试剂盒（美国LINCO Research公司）；睾酮试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）；兔抗鼠IGF?Ⅰ多克隆抗体（Labvision?NeoMarkers公司）；兔抗鼠抑制素α多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗鼠VEGF多克隆抗体（福州迈新生物技术开发公司）。
1.3 BHQR水煎浓缩剂的制备
取BHQR饮片置煎煮容器内，加相当于药材量5～7倍的冷水浸泡30 min，煮沸40 min，过滤。药渣加3～5倍量水继续煎煮，煮沸30 min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于生药量2.56 g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4 ℃冰箱备用。
1.4 动物模型制备
按随机数字表法将105只9日龄雌性幼鼠分为病理模型组和溶媒对照组，其中90只病理模型组幼鼠于分组当日在颈背部皮下一次性注射丙酸睾丸酮注射液0.05 ml（l.25 mg），15只溶媒对照组大鼠于颈背部皮下一次性注射中性茶油0.05 ml。两组大鼠均于出生21 d后断乳，70日龄始通过光学显微镜观察阴道脱落细胞涂片，连续观察10 d，阴道上皮细胞持续角化，无周期性，无排卵，提示雄激素致不孕大鼠（androgen?sterilized rats, ASR）动物模型制备成功。造模成功的大鼠进入后续实验，不典型的弃去不用。溶媒对照组大鼠70日龄后连续阴道脱落细胞涂片，呈现动情周期者取用。
1.5 动物分组及处理
30只病理模型大鼠按随机方法分为中药干预组和模型对照组，每组15只。80日龄起，按动物与人体表面积比换算法：人用药剂量（mg/kg）=0.16×大鼠用药剂量（mg/kg），换算相应剂量，中药干预组按10 ml/kg体质量灌服BHQR（含生药2.56 g/ml）；模型对照组及溶媒对照组每天灌胃同容积蒸馏水。每日早、晚各1次，连续30 d。用药结束后，根据阴道涂片，恢复性周期者，于110日龄后第一个动情前期断头处死，无性周期者于113日龄断头处死。
1.6 观察动情周期
大鼠灌胃20 d后，自99日龄至110日龄，每天作阴道涂片，将涂片行巴氏染色和脱落细胞学检查（以性周期规则出现为准）。依据大鼠性周期各阶段阴道涂片组织学特点，观察各组大鼠性周期变化情况来判断大鼠排卵情况。
1.7 胰岛素释放试验及血睾酮检测
晚8时禁食，次晨上午8时按3 g/kg体质量的葡萄糖剂量灌服50%葡萄糖溶液，灌糖0、0.5、1和2 h后眶静脉取血，将血静置2 h，离心（2 000 r/min）15 min，分离血清，置于－80 ℃冰箱，待测血INS。各时间点血INS采用放射免疫法检测，药盒质量控制指标均符合要求，批内、批间变异系数均<5.5%。大鼠乙醚吸入麻醉，抽取腹主动脉血4 ml左右，将血静置2 h后，离心（2 000 r/min）15 min，分离血清，置于－80 ℃冰箱，待测血睾酮。血睾酮检测采用放射免疫方法，其操作严格按睾酮放射免疫分析药盒说明书进行。药盒质量控制指标均符合要求，批内变异系数5.4%～7.4%、批间变异系数3.1%～6.1%。
1.8 卵巢INH、IGF?Ⅰ和VEGF免疫组织化学试验
卵巢组织石蜡切片常规脱蜡至水；经0.01 mol/L枸橼酸缓冲液微波抗原修复15 min；加50 μl 3% H2O2消除内源性过氧化氢酶，室温下孵育10 min，PBS洗3 min×3次；加入50 μl非免疫性动物血清，室温下孵育10 min；加50 μl兔抗鼠抑制素α或50 μl兔抗鼠IGF?Ⅰ或50 μl兔抗鼠VEGF，用PBS洗3 min×5次；加50 μl生物素标记的二抗，室温下孵育10 min，PBS洗3 min×3次；加50 μl链霉素抗生物素?过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min，PBS洗3 min×3次；100 μl DAB溶液显色10 min，蒸馏水洗3 min；苏木素复染10 min，PBS洗3 min×3次；75％乙醇分化30 s，流水冲洗10 min；经95％和100％乙醇10 min脱水，吹干，中性树胶封片。结果判断：对阳性染色采用MIQAS医学图像定量分析系统和医学图像定量分析软件进行分析，每张切片分析3个视野，每组数据至少18个，分析切片的阳性区域面积、阳性比率和光密度值。
1.9 统计学方法
用SPSS 11.0软件进行统计分析。计量资料采用组间t检验，非正态分布资料采用秩和检验，率的比较用χ2检验。
2 结 果
2.1 模型建立情况
90只造模实验大鼠经阴道脱落细胞涂片观察，发现其中30只大鼠（中药干预组15只，模型对照组15只）阴道细胞呈持续角化，丧失正常性周期，提示造模成功，用于后续实验。60只大鼠仍有性周期，造模失败，剔除。溶媒对照组15只大鼠涂片均有正常性周期，继续后续实验。
2.2 大鼠排卵情况
中药干预组15只大鼠，后有10只大鼠恢复性周期，提示自发排卵，排卵恢复率为66.67％（10/15），模型对照组15只大鼠经同容积蒸馏水干预后均未恢复性周期，提示无排卵，两组排卵率比较，差异有统计学意义（P<0.01）。
2.3 各组大鼠血睾酮情况
模型对照组血睾酮水平为（1.41±0.10）nmol/L，明显高于溶媒对照组的（0.41±0.02）nmol/L，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）；中药干预组血睾酮水平为（0.96±0.09）nmol/L，与模型对照组的（1.41±0.10）nmol/L相比，虽有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。
2.4 各组大鼠胰岛素释放试验
模型对照组各时间点的血INS水平均高于溶媒对照组（P<0.05）；与模型对照组比较，中药干预组0 min、30 min、60 min血INS水平下降（P<0.05）。见表1。表1 各组大鼠胰岛素释放试验结果（略）
2.5 各组大鼠卵巢组织INH、IGF?Ⅰ和VEGF的表达
依据公式：免疫组化阳性指数＝光密度值×阳性面积/总面积。模型对照组INH、IGF?Ⅰ和VEGF阳性表达均高于溶媒对照组（P<0.01）；与模型对照组比较，中药干预组阳性表达显著降低（P<0.01）。见表2和图1。表2 各组大鼠卵巢INH、IGF?Ⅰ和VEGF的表达（略）
3 讨 论
PCOS是妇科临床最常见的疾病之一，长期不排卵是该病一大临床特征，属中医“不孕症”范畴，与中医肾虚和西医性腺功能失调有关。高雄激素血症是PCOS的基本内分泌特征，目前认为主要是由于下丘脑?垂体?卵巢轴调节功能紊乱所致。高胰岛素血症是PCOS的病理生理特征［3］，其发生机制尚不清楚，可能跟受体前缺陷、受体缺陷、受体后缺陷及遗传因素等有关［4］。目前多数研究提示，高胰岛素血症也可引起高雄激素血症，其机制可能有以下两种：（1）刺激细胞色素p450 17α酶活性增加；（2）抑制肝脏性激素结合球蛋白的产生［5］。ASR动物模型较正常大鼠有高雄激素、无排卵和卵巢重量明显减轻等现象，卵巢多囊性改变与人相似，且有INS水平和胰岛素释放试验曲线明显升高，黄体生成激素和卵泡刺激素（follicle?stimulating hormone, FSH）水平低下，雌二醇（estradiol, E2）水平正常或升高等特点。本研究通过放射免疫方法检测发现，模型对照组大鼠的血睾酮、INS水平均高于溶媒对照组（P<0.05或P<0.01），符合PCOS高雄激素血症和高胰岛素血症的内分泌代谢特点。
卵泡从原始阶段发育到初级阶段的早期，其发育不受垂体促性腺激素的控制，而取决于卵泡本身的内在因素。PCOS各期卵泡包括窦前卵泡都较正常卵巢增多，这一现象提示了PCOS的原发障碍可能位于卵巢，因此对卵巢局部调控因子的研究是追溯病因的重要线索。在动物实验中，我们采用免疫组织化学方法检测发现，模型对照组大鼠卵巢组织的INH、IGF?Ⅰ和VEGF的阳性表达均高于溶媒对照组（P<0.01），阴道细胞持续角化，丧失正常性周期，无排卵发生。INH属转化生长因子β超家族成员，IGF?Ⅰ是由70个氨基酸组成的碱性多肽，VEGF是一种血管源性的生长因子。发生PCOS时，INH的分泌总量增高，使对FSH分泌反馈抑制作用增强，导致FSH分泌不足，促性腺激素的平衡被打乱，临床表现有闭经、持续无排卵等；多囊性和闭锁卵泡的颗粒细胞大量表达胰岛素样生长因子?Ⅰ受体（insulin?like growth factor?Ⅰ receptor, IGF?ⅠR），与患者体内增多的IGF?Ⅰ结合［6］，不断启动原始卵泡发育，促进间质细胞大量增生，促使初级卵泡发育，随着卵泡的生长，颗粒细胞IGF?ⅠR表达下降，又因为周围高雄激素环境，使卵泡生长发育受到制约，不能发育成熟；体内VEGF的表达增多，使非正常血管增生，导致卵巢局部FSH和睾酮水平增高，加上卵巢血管血流周期性改变发生异常，使卵巢性激素的周期性分泌改变，卵泡生长发育受到影响，导致排卵障碍。卵巢局部调控因子有多种，但对卵泡生长发育的最终影响，不是某一孤立因子所为，而是多种卵巢局部调控因子相互作用共同导致，上述3种因子之间也不是孤立存在而是相互作用、相互影响的。如Abd等［7］通过测定血清VEGF和IGF?Ⅰ的水平发现，在PCOS患者中不仅这两种因子的水平较高，而且二者之间存在正相关关系。虽然卵巢局部调控因子不能作为卵巢疾病一个独立的发病因素影响卵巢功能，但能通过与其他卵巢局部调控因子的连接而发挥重要作用。
我们认为PCOS的主要病机特点为本虚标实，本虚为肾虚，标实为瘀血内停、痰湿阻滞，治疗用BHQR，该方由当归、赤白芍、桑椹子、枸杞子、瓦楞子、制首乌、麦冬等组成，全方重在补肾，辅以活血、化痰，佐以调畅气血，使月经如期，并能摄精成孕。我们前期研究工作已证明该方的临床总有效率为93.48%，妊娠率为66.67%［2］。本研究进一步观察该中药方对ASR大鼠卵巢局部调控因子的影响，结果显示BHQR不仅能明显降低ASR大鼠的血INS水平（P<0.05），还能显著降低INH、IGF?Ⅰ和VEGF在卵巢局部的表达（P<0.01），大鼠排卵恢复率达66.67％，提示BHQR促使PCOS患者恢复排卵不是通过降低血睾酮水平，而是通过改善胰岛素抵抗，降低INH、IGF?Ⅰ及VEGF水平，改善卵巢内部环境，多途径、多靶点促使卵巢功能恢复，促进卵泡生长发育，诱发排卵。
【】
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7 Abd El Aal DE, Mohamed SA, Amine AF, et al. Vascular endothelial growth factor and insulin?like growth factor?1 in polycystic ovary syndrome and their relation to ovarian blood flow. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2005; 118(2): 219?224.
