丹参酮IIA对佐剂型关节炎大鼠离体胸主动脉环的舒张作用及对外周血vWF表达的影响

【摘要】  目的：研究丹参酮IIA（Tan IIA）对佐剂性关节炎（AA）大鼠离体血管的内皮依赖性舒张作用及外周血管假性血友病因子（vWF）表达的影响。方法：建立AA 大鼠模型并随机分组，各组连续给药3 周后处死大鼠。采用离体血管环灌流讲述观察各组给予去甲肾上腺素（NA）预收缩后加入乙酰胆碱（Ach）的内皮依赖性舒张作用，同时酶联免疫吸附法（ELISA）检测外周血vWF 含量。结果：与空白对照组相比，模型组、MTX 组血管环应用Ach 后对去甲肾上腺素（NA）引起的收缩反应的舒张率显著降低，Tan IIA 组与空白组相比差异无显著性；模型组vWF 水平最高，与空白对照组、MTX 组、Tan IIA 组差异具有显著性，Tan IIA 组水平最低。结论：AA 大鼠主动脉内皮依赖性舒张作用受损机制可能与内皮功能受损有关，Tan IIA 可以修复内皮细胞，改善RA 心血管损伤。

【关键词】  丹参酮IIA；血管环；血管假性血友病因子；佐剂型关节炎

    〔Abstract〕 Objective The aim of this study is to investigate the effect of Tanshinone IIA (Tan IIA) to thelevel of von Willebrand Factor (vWF) in serum and relaxant response depend on endothelium of isolated aortas inadjuvant arthritis (AA) mice. Methods Create animal model of adjuvant arthritis and randomization, after 3 weeksadministration kill the mice and get serum. vWF was assayed by ELISA. Determining relaxant response dependingon endothelium after adding Ach in organ bath with NA pre–contracted. Results The acetylcholine (Ach) inducedendothelium dependent relaxation are decreased in aortas from model group, MTX group. But there is no significantdifference between Tan IIA group and control group. vWF: Model group have the highest vWF level, has thesignificant difference comprared with control group、MTX group and Tan IIA group, Tan IIA group are lower than theother group. Conclusion Tan IIA can improve cardiovascular damage of Rheumatoid arthritis.

    〔Key Words〕 Tanshinone IIA; Vascular ring; Von Willebrand Factor; Adjuvant arthritis

    类风湿关节炎（RA）是一种以累及外周关节为主的炎性自身免疫病，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要病因之一[1]。近年来随着手段的不断提高，RA 病人生存期延长，心血管病并发症有逐渐增多的趋势。心血管并发症对RA 患者预后有着重要的影响，是风湿病的主要致死病因。一项研究表明[2，3] 在RA 患病人群中即使传统的危险因素如肥胖、吸烟、高脂血症等危险因素得到有效控制，仍然有很高的心血管病发病率。出现心血管并发症及其以后的恶化程度在很大程度上决定了风湿病的预后。

    丹参酮IIA（Tanshinone IIA, Tan IIA）有明确的心血管保护作用，但对关节外如心血管收缩与舒张功能的影响及机制尚不清楚。本研究旨在探讨丹参酮IIA 使用在控制RA 病情及减少心血管并发症方面起到的防治作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物 清洁级Wistar 大鼠32 只，雌雄各半，体重120~140 g，购自中山医科大学实验动物中心。

    1.1.2 药品 卡介苗，上海生物制品研究所；液体石蜡，江西德成科技有限公司；羊毛脂，天津光复精细化工研究所：冰醋酸，天津标准科技有限公司；甲氨蝶呤片，上海医药有限公司；丹参酮IIA 磺酸钠（纯度96.8%），西安天丰生物科技有限公司；重酒石酸去甲肾上腺素，武汉远大制药有限公司；乙酰胆碱，北京化学试剂公司。

    1.1.3 试剂 vWF 定量ELISA 试剂盒、TNF–α 定量ELISA 试剂盒，上海西唐生物科技有限公司提供。克氏液（mmol/L）：NaCl 118、KCl 4.7、MgSO4 1.2、NaHCO3 2.5、CaCl2 2.5、Glouse 11.1。福氏完全佐剂(FCA，Sigma 公司)。

    1.1.4 仪器 RM6240 多导生理信号采集处理系统，成都仪器厂；GS501 型超级恒温水浴，上海浦东仪器有限公司；JZ101 肌肉张力换能器，高碑店市新航机电设备有限公司；RE–52A 一维位移微调器，成都仪器厂；TG628A 型分析天平，上海天平仪器厂；VERSAmax 型酶标仪。

    1.2 方法

    1.2.1 AA 大鼠模型的建立 将同一批次的FCA于80℃灭活1 h，用高压灭菌的液体石蜡配成所需浓度（FCA10 mg/mL）充分振荡摇匀，每只Wistar大鼠的尾巴中内1/3 交界处注射0.1 mL。另取8 只Wistar 大鼠，相同部位注入等量生理盐水。
   
    1.2.2 分组 造模3 周后将出现2 次反应的大鼠随机分为模型组、甲氨喋呤组（MTX 组2.6 mg·kg-1·w-1）、丹参酮IIA 组（Tan IIA 组32 mg·kg-1·d-1），每组8 只，注入生理盐水的为空白对照组。

    1.2.3 关节炎评估 采用关节炎评估标准[6]（Arthritis index, AI）进行评估：0 分：正常；1 分：红肿涉及1 个指关节；2 分：红肿涉及2 个以上指关节或整个足爪轻度肿胀；3 分：足爪红肿较重；4分：足爪重度红肿，缺乏弹性。每只足爪损害均分为0~4 分，4 只足爪总积分，造模3 周后AI 值≤ 5 的大鼠弃用。

    1.2.4 大鼠离体血管内皮依赖性舒张功能的测定 给药3 周后，用10% 水合氯醛对大鼠腹腔麻醉，经腹主动脉取血，留取血清。迅速打开胸腔，取出胸主动脉，置于盛有通入95% O2 + 5% CO2 混合氧，pH（7.4±0.05）克氏液的平皿中，分离去除血管周围的脂肪及结缔组织，剪成3~4 mm 的血管环悬挂于通有混合氧的37℃克氏液浴槽中，下端固定，上端与张力换能器相连，换能器与多道信号记录仪相连，信号转录于电脑上。标本给予2 g 前负荷，平衡1 h，15 min 换液1 次，平衡后向浴槽内加入2×10-8 mol/L 去甲肾上腺素（NA）观察30 min 收缩至最大值后加入1×10-5 mol/L Ach，观察50 min 内的舒张率。舒张率=（各组收缩最大值– 各组舒张最小值）/（各组收缩最大值– 基础张力值）×100%。

    1.2.5 vWF 的检测 严格按照ELISA 试剂公司提供的说明书进行操作。

    1.2.6 统计方法 所有数据均采用SPSS 13.0 软件包进行统计学处理，所得结果以表示，各组间比较采用单因素方差分析，首先进行方差齐性检验，在此前提下应用LSD 法对各组间差异进行比较。

    2 结 果

    2.1 各组大鼠关节炎指数比较前后，除正常对照组外，各组AI 值均有明显变化，给药前，模型组、MTX 组和Tan IIA 组组间无差异（P ＞ 0.05），给药结束后，模型组与MTX组和Tan IIA 组有显著性差异（P ＜ 0.01），见表1。表1 治疗前后关节炎指数的比较

    2.2 各组大鼠离体主动脉环内皮依赖性舒张功能的比较主动脉环对2×10-5 mmol/L 乙酰胆碱（acetylcholine, Ach）引起内皮依赖性舒张作用中，与空白对照组（95.74±4.63）% 相比，模型组，MTX 组，血管环应用Ach 后对2×10-8 mmol/L NA 引起收缩反应的舒张率显著降低（P ＜ 0.01），Tan IIA 组与空白组相比差异没有显著性。结果见表2。表2 各组动脉环舒张作用的比较与对照组比较，* P ＜ 0.01。

    2.3 各组大鼠血清vWF 水平比较模型组vWF 水平最高，与空白对照组、MTX组、Tan IIA 组差异具有显著性， 空白对照组、MTX 组Tan IIA 组vWF 水平差异无显著性（P ＞0.05），但Tan IIA 组vWF 水平最低。结果见表3。表3 Tan IIA 组对外周血vWF 的作用

    3 讨 论

    佐剂性关节炎大鼠在临床表现、实验室指标和病理机制上与人RA 在临床表现、病理、免疫有着十分相似的特点：AA 大鼠的免疫功能变化兼有体液免疫和细胞免疫，T、B 细胞共同参与其发病，它存在明显的滑膜增生和软骨破坏等现象，更好的模拟了炎症因子在RA 发生中的病理改变[5]。内皮功能障碍在RA 合并心血管损害的机制主要表现在三方面：内皮源性血管收缩、舒张因子调控异常；调节凝血、抗凝机制的异常；循环内皮组细胞减少，内皮细胞修复受限。近年的研究发现，在血管的壁层甚至血管外膜，亦有内皮层存在[7]。血管壁和内皮处于不断的机械、化学损伤与修复中。研究表明，源于骨髓的内皮组细胞和内皮前体细胞有助于血管和组织修复[8]。在组织再血管化部位，内皮细胞可来源于周围已经存在的血液细胞，亦可来自骨髓源的循环内皮前体细胞集聚。当用于修复的内皮前体细胞数量减少或功能降低时，内皮功能则发生障碍。

    本研究证实，AA 大鼠离体血管环对Ach 的内皮依赖性舒张反应明显下降，Tan IIA 治疗组大鼠较模型组明显增强，其舒张反应接近正常大鼠，此可能与其抑制vWF、ET–1 等炎性因子的表达，提高内皮eNOs 的释放从而使内皮损伤得到修复有关。血管内皮细胞直接与血液接触，在调节凝血和抗凝机制中起重要作用。内皮细胞可以合成和释放多种促凝和抗凝因子，vWF 是重要的促凝因子之一。炎症介质及其效应细胞通过直接或间接途径操作内皮细胞后，组织因子的释放和内皮下胶原的暴露将会引起血小板聚集和外源性凝血途径的启动，病变的内皮细胞失去了对凝血的调节功能，导致病变局部的血管内血栓形成。在这些血栓因子中，vWF 的升高有着重要的意义，它是一种广泛存在于血浆的糖蛋白，在血管受损时参与血小板聚集，将血小板受体与受损的内皮下膜连接，使血小板聚集增多，干扰了正常的凝血、抗凝机制。有人[6] 对无心血管危险因素的RA 女性患者的颈动脉内膜中层厚度（IMT）和vWF 之间的关系作了研究，发现RA 组IMT 显著高于空白对照组，vWF 水平也较空白对照组升高，认为IMT 和vWF 定期检测有助于检测动脉粥样硬化的进程。

    本实验结果显示，Tan IIA 能显著降低血清vWF 水平，并且作用优于单用MTX，说明Tan IIA起到内皮损伤的修复作用。

【】
  1〕 叶任高, 陆再英. 内( 第6 版)〔M〕. 北京: 人民卫生出版社, 2004.885

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〔4〕 Larson P. Homologous type II collagen induced arthritis inrats〔J〕. Arthritis Rheum, 1990, 33:693-701

〔5〕 Brand DD, Kang AH, Rosloniec EF. Immunopathogenesisof Collagen Arthritis〔J〕.Springer Semin Immunopathol,2003, 25:3-18

〔6〕 Daza L, Aguirre M, Jimenez–M, et al. Common carotidintima-media thickness and von Willebrand factor serumlevels in rheumatoid arthritis female patients without

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〔7〕 Herrmann J, Lerman LO,Rodriguez–Porcel M,et al.Coronaryvasorum neovascularization recedes opiacardial endothelialdysfunction in experimental hypercholesterolemia〔J〕.Cardiovasc Res, 2001, 51:762-766

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