梗阻性黄疸大鼠中性粒细胞凋亡的实验研究

                     作者：高海斌 陈斌 倪勇 邓雪松 王成友 张敏杰

【摘要】  目的：探讨梗阻性黄疸大鼠外周血中性粒细胞凋亡的改变。方法：将 66 只成年 Wistar 大鼠随机分为正常（A） 组、假手术（B）组和胆总管结扎（CBDL, C）组，B、C 组术后又分为 1、3、7、10、14 d 5 个时相点；应用流式细胞仪检测中性粒细胞（PMN）的凋亡指数（AI），通过 ELISA 双抗体夹心法测定血清 IL-8。结果：C 组大鼠术后各时相点 PMN的 AI 显著降低，与 A 组和 B 组均有显著差异（P < 0.05）；C 组大鼠术后各时相点血清 IL-8 水平显著升高，与 A 组和 B 组均有显著差异（P < 0.05）；且血清 IL-8 水平与 PMN 的 AI 的改变有显著负相关性。结论：梗阻性黄疸大鼠外周血 PMN 的 AI 明显降低，且与 IL-8 水平异常升高有关，在梗阻性黄疸过度炎症反应的发生、中有着重要意义。

【关键词】  胆道梗阻；中性粒细胞；凋亡；细胞因子；IL-8

    〔Abstract〕Objective     To  investigate  the  changes  of  apoptosis  of  peripheral  polymorphonuclear  neutrophil(PMN)  in  the  rats  with  obstructive  jaundice.    Methods     66  Wistar  adult  rats  were  randomly  divided  into  three groups:  normal  group  (group  A),  sham  operation  group  (group  B)  and  common  bile  duct  ligation  group  (CBDL,  group  C),  and  each  group  were  randomly  divided  to  subgroups  of  day  1,  3,  7,  10,  14  again.  The  flow  cytometry  was  used  to  detect  and  evaluate  the  change  of  apoptosis  in  vitro  after  PMN  were  harvested from  the  rats.  IL-8  was  detected  by  ELISA  method.    Results     Apoptosis  index  (AI)  of  PMN  in  group  C  was  lower  than  in  groups  A  and  B  at  1,  3,  7,  10,  14  days  after  CBDL;  The  level  of  IL-8  in  serum  in  group C  was  higher  than  in  groups  A  and  B  at  1,  3,  7,  10,  14  days  after  CBDL.  Moreover,  there  was  a  marked  negative correlation  between  AI  and  level  of  IL-8.    Conclusion     The  apoptotic  PMN  is  decreased,  which  is  intimately associated  with  the  level  of  IL-8,  which  may  induce  excessive  inflammation,  and  play  a  crucial  role  in  the  initiation and  development  of  obstructive  jaundice.

    〔Key  Words〕    Obstructive  jaundice;  Polymorphonuclear  neutrophil;  Apoptosis;  Cytokine;  IL-8

    　　中性粒细胞（Polymorphonuclear neutrophil, PMN）是机体非特异防御反应的重要执行者，在炎症反应中扮演重要角色，在有效地发挥防御功能，避免炎症的加强、扩散和迁移的方面具有重要作用[1]。我们之前的研究表明，梗阻性黄疸大鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力异常，不能及时清除凋亡的 PMN，导致机体免疫功能障碍[2]，但有关 PMN 凋亡功能改变的研究却鲜有报道。为此，在此基础上，我们应用流式细胞术检测大鼠梗阻性黄疸后外周血 PMN 凋亡的改变并试探讨其意义及发生机制。

    1    材料与方法

    1.1    实验动物分组及模型制备    健康成年 Wistar 大鼠 66 只（第一军医大学动物中心），雌雄各半，体重 220~280 g，随机分为 3 组：①正常对照（A）组（n = 6），定为 0 时相；②假手术对照（B）组（n = 30），分术后 1、3、7、10、14 d 5 个时相点，每个时相点 6 只；③胆总管结扎（C）组（CBDL，n = 30），分为术后 1、3、7、10、14 d 5 个时相点，每个时相点 6 只。

    CBDL 模型制备：乙醚吸入麻醉，上腹正中切口进腹，近十二指肠双重结扎胆总管，并于两结扎线之间切断。B 组除不结扎和切断胆总管外，其余同上；A 组不作任何处理。术后实验大鼠自由饮水进食，于术后相应时相点处死。

    1.2    主要试剂与仪器    流式细胞仪（Beckman Coulter 公司 XL 型），Annexin-V-FITC 试剂盒购于 Bender 公司，RPMI 1640 培养基购于 Gibco 生物技术公司，中性粒细胞分离液购于上海华精生物科技有限公司。

    1.3    中性粒细胞的分离与纯化    取肝素抗凝静脉血样，于室温下静置 1 h 或离心 2 000 r/min、15 min，然后吸取富含白细胞的“白膜层”。然后应用 Ficoll （聚蔗糖）- Hypaque（泛影葡胺）密度梯度离心法[3] 行中性粒细胞的分离与纯化，最后台盼蓝染色法检查 PMN 活力 > 98%，瑞氏染色法检查 PMN 纯度 > 95%。

    1.4    PMN 凋亡指数检测    取纯化 PMN，调整细胞浓度为 1×106/mL，加入 5   L Annexin-V 和 10   L 碘化丙锭（PI），室温避光 15 min。然后加入0.4 mL 1×Binding 缓冲液上流式细胞仪检测。采用Annexin-V 和 PI 双标法，双通道检测 5 000 个细胞，激发光波长 488 nm，发射光波长 515、560 nm。Annexin-V + / PI - 的为凋亡细胞，Annexin-V + / PI + 的为坏死细胞，Annexin2V - / PI - 的为活细胞，计数凋亡细胞占的百分比作为凋亡指数。

    1.5    血清 IL-8 检测    严格按试剂盒说明书要求操作，根据标准品得出的 A（OD）值绘制标准曲线，出样本中 IL-8 的浓度。

    1.6    统计学方法    实验结果以 x±s 表达，采用方差分析；t 检验；直线相关分析。

    2    结    果

    2.1    外周血 WBC 及 PMN 的数量变化    随着胆道梗阻时间的延长，C 组外周血 WBC 数目不断增加，且以 PMN 升高为主，呈明显的时间依赖性改变。B 组 WBC 和 PMN 在术后变化不大。C 组各时相点 WBC 和 PMN 均明显高于 A 组及 B 组相应时相点。

    2.2    外周血 PMN 的凋亡指数和血清 IL-8 水平    见表 1 和表 2。C 组中各时相的凋亡指数与 B 组同一时相点和 A 组相比较差异均有统计学意义（均为 P < 0.05）。C 组血清 IL-8 各时相水平与 B 组同一时相点和 A 组相比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。

    2.3    相关性分析    通过对 C 组血清 IL-8 水平与 PMN 的凋亡指数进行相关分析（r = -0.909，P < 0.0001），表明 IL-8 水平与凋亡率存在显著负相关性。

    3    讨    论

    PMN 作为机体非特异防御反应的重要执行者，它以凋亡的方式死亡，并被巨噬细胞识别、吞噬而清除，对维持内环境的稳定和促使已发生炎症的局限及消退具有重要意义[1]。因此，凋亡被认为是机体清除具有潜在损害活性的 PMN 有效的生理调节机制。当 PMN 凋亡减少或延迟，大量滞留于机体组织，过度、持续地活化并产生大量的活性氧自由基和多种蛋白水解酶，加重炎症反应和组织损伤，甚至引发全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征[4，5]。

    梗阻性黄疸后围手术期易并发感染和败血症与机体免疫功能的紊乱，与炎性细胞机能的改变有明显的关系[2]。本实验结果显示，随着胆道梗阻的形成和时间的延长，BDL 大鼠外周血的 WBC 数量不断上升，尤其以 PMN 升高为主，呈现时间依赖性变化。并且，CBDL 大鼠术后 1 d PMN 开始凋亡，且随着病程的延长逐渐降低。这说明 CBDL 大鼠的 PMN 不仅存在数量增加，而且凋亡贯穿于梗阻性黄疸的始终，这必将在梗阻性黄疸感染和脓毒血症的发生、中起着十分重要的作用。

    IL-8 是机体内一种重要的细胞因子，其主要靶细胞是 PMN，对 PMN 起特异性的趋化和活化作用，并可诱导它进入炎症部位，促进变形、脱颗粒、释放溶酶体酶、产生超氧化物，并延长存活时间和增强活性功能[6]。本实验结果显示，CBDL 大鼠术后血清 IL-8 水平逐渐升高，且与 PMN 的凋亡指数的变化呈现负相关。我们认为，IL-8 异常升高可能是引起 PMN 凋亡延迟的原因之一，导致持续、过度的炎症反应和组织损伤。而 IL-8 参与细胞凋亡调节的具体机制目前尚未明确。

    总之，CBDL 大鼠存在 PMN 凋亡的延迟，与细胞因子 IL-8 水平的升高密切相关。深入了解外周血 PMN 凋亡变化的意义，有利于揭示梗阻性黄疸易发感染和脓毒血症的机理，为临床提供可靠的理论依据。

【】
  〔1〕Chilvers ER, Cadwallader KA, Reed RJ, et al. The function and fate of neutrophils at the inflamed site: prospects for therapeutics intervention〔J〕. JR Coll Physicians Lond, 2000, 34(1):68-74

〔2〕倪勇, 高海斌, 刘琰, 等. 梗阻性黄疸大鼠腹腔巨噬细胞凋亡和吞噬功能的改变〔J〕. 中华实验外科杂志, 2004, 21(12): 1425-1427

〔3〕刘文超, 刘智广, 张晓楠, 等. 外周血中性粒细胞的分离方法〔J〕. 细胞与分子免疫学杂志, 1996, 12(4):64-66

〔4〕Diebel LN, Liberati DM, Taub JS, et al. Intestinal epithelial cells modulate PMN activation and apoptosis following bacterial and hypoxic challenges〔J〕. J Trauma, 2005, 58(6): 1126-1133

〔5〕Lea F, Luciano FF, Mary CB, et al. Neutrophil apoptosis: a marker of disease severity in sepsis and sepsis-induced acute respiratory distress syndrome〔J〕. Crit Care, 2006, 10(6):R155

〔6〕Matsuda T, Saito H, Fukatsu K, et al. Cytokine-modulated inhibition of neutrophil apoptosis at local site augments exudative neutrophil functions and reflects inflammatory response after surgery〔J〕. J Surgery, 2001, 129(1):76-85