壮元扶骨逍遥汤治疗膝骨关节炎的实验研究

             作者：马永健 李青 王金榜 张丽娜

【摘要】  　　目的 观察壮元扶骨逍遥汤对家兔膝骨关节炎模型血清中超氧化物歧化酶（SOD）和关节液中白介素-1（IL-1）含量的影响，并探讨其作用机制。方法 将新西兰白兔36只，雌雄不分，随机分成4组，即正常组（N组）、模型对照组（M组）、壮元扶骨逍遥汤组（F组）、布洛芬组（P组），各8只，于相同温度、湿度下分别单笼喂养，在前、中、后分别提取家兔的血清和关节液，采用免疫组织化学法检测血清SOD和关节液IL-1的含量。结果 治疗前比较，M、F、P组SOD水平明显降低（P＜0.05），IL-1水平明显升高（P＜0.05）；治疗中、后期比较，F组SOD水平明显升高（P<0.05），P组无明显变化（P>0.05），F、P组IL-1水平明显降低（P<0.05）。结论 壮元扶骨逍遥汤可提高血清SOD水平，通过激活SOD的活性而使其含量显著升高，催化氧自由基发生歧化反应，阻止过多氧自由基对关节软骨的损害，保护关节软骨，提高软骨细胞功能，促进软骨修复；降低关节液IL-1水平，可有效清除促炎性细胞因子，减轻炎症对关节软骨的破坏及所产生的疼痛，可能是通过抑制巨噬细胞的分泌来起效的。

【关键词】  骨关节炎；膝；动物；实验；壮元扶骨逍遥汤

　　Experimental investigation on treating osteoarthritis of the knee with Zhuangyuanfuguxiaoyao decoction 
   
　　【Abstract】  Objective  To observe the influence of Zhuangyuanfuguxiaoyao decoction on SOD in blood serum and IL-1 in synovial fluid of knee osteoarthritis rabbit model, and reveal the mechanism of action. Methods  36 well-being New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 group, they are normal group(group N), model reference group(group M), Zhuangyuanfuguxiaoyao decoction group(group Z), ibuprofen group(group P), 8 rabbits in each group. The rabbits blood serum and synovial fluid were extracted in pre-treatment, meta- treatment and post- treatment, and SOD and IL-1 levels were detect with the immunohistochemistry. Result  The concentration of SOD in group M, group Z and group P before treatment could markedly reduce compared with that in group N (P<0.05), and the concentration of IL-1 increased (P<0.05). The concentration of SOD meta- treatment and post- treatment group Z was higher than those pre-treatment (P<0.05), but group P there was no significant difference (P>0.05). The concentration of IL-1 meta- treatment and post- treatment group Z and group P were lower than those pre-treatment (P>0.05). Conclusion  Zhuangyuanfuguxiaoyao decoction can enhance the level of blood serum SOD by activating activity of SOD, and prevent damage of arthrodial cartilage from  oxygen  radical by catalyzing dismutation reaction of oxygen  radical. Zhuangyuanfuguxiaoyao decoction can reduce the level of  IL-1 in synovial fluid and effectively by inhibition of macrophage secretion.
   
　　【Key words】  Osteoarthritis; Knee; Animal; Experiment; Zhuangyuanfuguxiaoyao decoction

　　膝骨关节炎作为中老年人的常见病、多发病，以膝关节肿痛、畸形和功能障碍为主要表现，是引起中老年人疼痛和伤残的主要原因之一。其基本病理变化是膝关节软骨退变。医学认为骨内压升高，金属蛋白酶（MMPs）及其抑制物（TIMPs）失衡，破坏性细胞因子、炎性介质、生长因子、氧自由基、自身免疫反应的增加，透明质酸（HA）分泌减少等对其病理变化具有重要作用［1］。我们通过建立膝骨关节炎(KOA)动物模型，应用纯中药制剂壮元扶骨逍遥汤干预，观察其对血清超氧化物歧化酶(SOD)及关节液白介素-1(IL-1)的影响来探讨其治疗的可能机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物  健康6～8个月龄，体质量（3±0.1）kg，新西兰白兔36只，雌雄不分，由河北医科大学实验动物中心提供,实验动物合格证号：D0561620。

　　1.1.2  主要试剂  ①木瓜蛋白酶，由河北博海生物工程有限公司提供，MERCK公司产品，批号：000607。②试剂盒，SOD、关节液中IL-1放免试剂盒由解放军总科技开发中心放免所提供，标号100T。

　　1.1.3  主要仪器  国营二六二厂FJ-2021γ放射免疫计数器，放射性免疫γ射线计数分析工作站，上海安亭科技仪器厂GL-20B高速冷冻离心机。

　　1.1.4  主要药品及制备  ①壮元扶骨逍遥汤由熟地黄、肉苁蓉、黄芪等药物组成，采购于河北省中医院，由其制剂室韩国煎药机制备，每剂药装2袋，每袋约100 mL。②布洛芬片剂，0.1 g/片，由浙江康恩贝制药有限公司提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物饲养  36只实验兔于相同温度、湿度下分别单笼喂养。每日早晚各喂1次，水300 mL，专用兔料（由河北医科大学实验动物中心提供）100 g。

　　1.2.2  实验动物分组  将实验动物随机分为正常组（N组）8只，模型对照组（M组）8只，壮元扶骨逍遥汤组（F组）8只，布洛芬组（P组）8只，余4只候补备用。

　　1.2.3  动物模型制作  ①备皮：蘸取10% Na2S溶液给M、F、P组实验兔双后腿膝关节周围皮肤均匀脱毛后，用大量清水冲洗干净。②造模：以实验兔专用兔兜（自制）固定实验兔于四角支架上，四肢和头颈可活动。碘酒、酒精常规消毒膝关节局部皮肤。将4℃、1.6%的木瓜蛋白酶溶液2 mL，从前外侧入路注入双后腿膝关节腔内，隔3日1次，共注射3次，注射剂量分别为2、1、1 mL。于第3次注射完毕的第1日起，可认为获得稳定的膝骨关节炎模型［2］。

　　1.2.4  给药方法  ①F组，用20 mL注射器抽取壮元扶骨逍遥汤药液经内径5 mm的灌胃管灌入兔胃，每次100 mL，每日2次，15日为1个疗程，共2个疗程。注意观察实验兔有无呛咳，防止灌胃管进入气管中。②P组，方法同上，将布洛芬片剂捻碎溶入水中灌胃，每次0.3 g，每日3次。③N组、M组正常喂养即可。

　　1.2.5  取材方法  将实验兔用兔兜固定，碘酒、酒精常规消毒双后膝关节局部皮肤，以50 μL微量注射器从前外侧入路进膝关节腔，抽取关节液20 μL，注入5 mL灭菌EP管中，定容至2 mL，密闭和编号后-20℃保存。同时用5 mL注射器抽取兔耳背动脉血2 mL，也注入5 mL灭菌EP管中，密闭和编号后-20℃保存。于治疗前、中、后各取材1次。

　　1.3  观测指标  采用放射性免疫吸附法检测血清SOD和关节液IL-1的含量。

　　1.4  统计学处理  各组数据均采用均数±标准差（±s）表示，用SAS软件对组间和组内数据做正态检验和方差齐性检验后，再做完全随机设计的方差分析和SNK-q检验。

　　2  结果

　　2.1  治疗前、中、后各组血清SOD的含量比较  见表1。

　　表1  治疗前、中、后各组血清SOD的含量（略）

　　与N组治疗前比较,△P>0.05;与本组治疗前比较，?P＜0.05；与P组比较，◇P＜0.05

　　由表1可见，治疗前，N组与M、F、P组间比较差异有统计学意义（P<0.05），M、F、P组间比较差异无统计学意义（P>0.05），这说明造模成功。治疗中、后期，F组SOD水平明显升高（P<0.05），P组无明显变化（P>0.05），组间比较差异有统计学意义（P<0.05），继做SNK-q检验示，M、P组间差异有统计学意义（P＜0.05），余2组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

　　2.2  治疗前中后各组关节液IL-1的含量比较  见表2。

　　表2  治疗前中后各组关节液IL-1的含量（略）

　　治疗前M组、F组、P组组间比较,△P>0.05;治疗中、后与本组治疗前比较，?P<0.05；与P组比较，◇P<0.05

　　治疗前，N组与M、F、P组组间比较差异均有统计学意义（P<0.05），M、F、P组间比较差异无统计学意义（P>0.05），这说明造模成功。治疗中、后期，F、P组IL-1水平明显降低（P<0.05），继做SNK-q检验示，F、P组间差异无统计学意义（P>0.05），余2组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

　　3  讨论

　　3.1  动物造模的可行性  KOA的动物模型有很多种，如兔后肢膝关节伸直位固定法［3］；手术结扎家兔一侧股静脉及臀下静脉致后肢静脉回流受阻，造成胫骨内高压，引发KOA的方法等［4］。但兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶造模法所需时间最短，效果也稳定持久，可模拟软骨破坏的终末环节，是研究软骨病理、药物预防与的一种较优秀的方法。本实验造模组与正常组血清SOD和关节液IL-1的含量比较差异有统计学意义（P<0.05），说明造模成功。

　　3.2  SOD对KOA的作用机制  SOD是机体内存在的一类抗氧化酶，是一种轻微疏水的糖蛋白，分子量约为135KD，通常以四亚基形式存在，其功能主要是清除细胞生命活动中产生的过多的氧自由基［5］。在KOA关节液中有大量的氧自由基存在，以一氧化氮（NO）为例，倪江东［6］测试表明KOA患者关节液中NO含量较正常人高，差异有统计学意义；NO作为一种生物活性很强的氧自由基，在正常情况下有宿主防御作用，但其含量过高则可造成Ⅱ型胶原蛋白的氧化损伤，导致氨基酸含量及胶原蛋白构象改变，使胶原纤维受损，不能有效地保护关节软骨细胞，关节软骨发生营养障碍，而且NO还可直接引起软骨细胞凋亡以及诱导MMPs活性加速软骨基质的降解［7］。而SOD正是过多氧自由基如NO等的克星，可以催化氧自由基发生歧化反应，阻止过多氧自由基对关节软骨的损害，保护关节软骨，提高软骨细胞功能，促进软骨修复，延缓软骨的退变，同时还可抑制滑膜炎性改变。

　　3.3  IL-1对KOA的作用机制  IL-1作为一种发现最早的促炎性细胞因子，是一种分子量为17.5KD的多肽，分为а、β两类，主要来源于巨噬细胞。医学已经证明其在KOA患者关节液中含量明显升高，对KOA的发生起重要作用［8］。其作用主要有以下几点：①有快速强大的促炎症作用，主要是刺激滑膜细胞合成并释放前列腺素2（PGE2），引起滑膜炎症和关节的疼痛；②刺激软骨细胞合成诱导型一氧化氮合酶（iNOS），产生NO，增加基质降解，参与关节炎的炎症活动；③作为一种有效的MMPs诱导剂，可促进MMPs合成且通过胞浆素原激活物的分泌促进MMPs活化，同时抑制胞浆素原激活物抑制物的合成，抑制TIMPs的产生，导致MMPs/TIMPs失衡，而MMPs/TIMPs失衡MMPs增多，则可抑制软骨细胞合成具有透明软骨特性的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，促进生成有纤维母细胞特性的Ⅰ型胶原，使软骨细胞变性，关节软骨肿胀，抗外力作用下降，最终导致关节软骨糜烂、溃疡、缺失等一系列退变［9］。虽然IL-1作用很多，但最主要的还是其快速强大的促炎症作用。

　　3.4  壮元扶骨逍遥汤防治KOA作用机制的分析  KOA的基本病理变化是关节软骨的退变，其治疗方向主要是消除关节炎症、保护关节软骨、延缓软骨退变和促进透明软骨的再生。中医学认为，元气具有推动、温煦、生津行津之功，可直接温养、滑利关节软骨，元气虚衰，筋骨失养则诱发KOA。据此我院以“培元固本、生津荣骨”为治疗法则组成壮元扶骨逍遥汤，在我院近10年的临床应用中取得了良好疗效，尤其对改善关节的晨僵、肿痛等起效快，疗效显著且持久。从实验结果看，壮元扶骨逍遥汤通过激活SOD的活性而使其含量显著升高，催化氧自由基发生歧化反应，阻止过多氧自由基对关节软骨的损害，保护关节软骨，提高软骨细胞功能，促进软骨修复，延缓软骨的退变。有研究也证明黄芪能够提高SOD活性［10］。同时，壮元扶骨逍遥汤与布洛芬在降低关节液IL-1水平上无明显差异，说明壮元扶骨逍遥汤可有效清除促炎性细胞因子，减轻炎症对关节软骨的破坏及所产生的疼痛，其可能是通过抑制巨噬细胞的分泌来起效的。另外，壮元扶骨逍遥汤还具有活血化瘀、温经散寒的功效，其可能通过改善骨内微循环，降低骨内高压，以减轻骨内高压对软骨的损害。如许学猛等［11］证明活血化瘀法可有效防治KOA骨内高压的发生发展。

　　3.5  壮元扶骨逍遥汤防治KOA的前景和存在的问题  本实验对壮元扶骨逍遥汤进行了初步的研究，与布洛芬相比较，在降低关节液IL-1水平上无明显差异，但在提高血清SOD水平上要优于布洛芬，表明壮元扶骨逍遥汤近期疗效与布洛芬无显著性差异，远期疗效则优于布洛芬，显示出中药在抗炎止痛、促进软骨修复等方面具有良好的发展前景，有利于中药新药的开发和临床推广应用。但由于壮元扶骨逍遥汤是复方中药，药物众多，尤其是煎制后药物间发生化学反应生成的成分更加复杂，因此方中哪些药物或成分在起主要作用，它们是通过什么途径来起作用的，是否还存在着损伤软骨细胞的成分，是否存在除了口服之外的更佳给药途径，这些问题都有待进一步研究。

【】
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