T细胞受体信号转导通路的动力学分析
作者：刘顺会 肖兰凤 黄树林
【摘要】 目的：建立T细胞受体信号转导途径的动力学模型，通过模型仿真揭示T细胞受体信号途径各分子间的动态调控过程，简要分析模型的动力学特性。方法：根据数据库KEGG及相关中，提取T细胞受体信号转导各条通路相关分子作用的方式及数量关系，利用Matlab7.0的Simulink工具箱构建信号途径的动力学模型并仿真。结果：模型仿真结果与文献符合得较好，能够从数量上反映T细胞受体信号转导途径中各分子间复杂的调控关系，并能通过模型仿真发现和验证该信号途径中的关键节点分子。结论：模型基本反映了T细胞受体信号转导途径的动力学特征，可以作为后续的精确定量关系研究的基础。
【关键词】 T细胞受体； 信号转导； 动力学模型
T细胞特异性抗原或TCR/CD3的特异性抗体可引起T细胞跨膜受体以及膜附近的其它信号分子的活化，并引起T细胞形态改变、细胞因子分泌、细胞粘附性改变等免疫应答，从而调节T细胞的增殖、分化或凋亡，该过程涉及一系列下游信号转导和基因表达调控。T细胞活化时信号传递由T细胞表面抗原识别受体（T cell receptor, TCR）介导，外来信号经受体及相关蛋白传递给胞内的蛋白酪氨酸激酶，此后启动三条下游信号途径：一为磷脂酶C-γ1（Phospholipase-Cγ1，PLC-γ1）介导的信号途径，二为Ras-MAPK途径，三为共刺激分子介导的磷酸肌醇激酶-3（PI3K）辅助信号途径。同时，为保持免疫应答的平衡，避免过度活化，T细胞的活化过程还受到抑制性信号通路的调节，这些通路彼此交织，构成一个十分复杂的T细胞活化调控［1］。
随着各种复杂的信号转导网络中各个分子通道的确定，如何从系统水平上定量地分析各信号转导网络的动态特征就成为当前系统生物学的研究重点。除各种并行、高通量的实验技术外，数学建模和仿真是另外一种研究复杂生化网络的强有力手段，比如在细胞代谢研究领域已经很广泛地利用数学模型分析具有多个调控环的代谢网络［2］。实践表明，通过建立生化网络的数学模型并进行机仿真能够拟合现有的实验数据，解释实验中观测到的现象，预测一些不能通过当前实验手段获得的结果，减少实验的强度和数量，并验证实验提出的可能机制。
本研究建立了T细胞受体信号转导途径的动力学模型，通过模型仿真揭示了T细胞受体信号途径各分子间的动态调控过程，并对模型的动力学特性进行了简要分析。
1 材料与方法
1.1 T细胞受体信号转导途径
T细胞受体信号转导途径（图1）摘自KEGG数据库（http://www.genome.jp/kegg/）。本研究根据相关中英文文献，对图中涉及的信号转导相关分子之间的作用方式及数量关系进行了详细研究和确证，并据此定义整个信号转导途径的变量（包括自变量和因变量）和变量之间的关系。
1.2 动力学建模
本研究采用S-系统方程（S-system equations）［2］来描述信号转导的生化级联反应过程。对于含有n个因变量X1，X2，…，Xn（其数量随时间而变化）和m个自变量Xn+1, Xn+2, …，Xn+m（一般设定为某些不变常量）的生化级联反应系统，其动力学时变方程可以表达为：
dXi / dt=V+i-V-i i = 1, 2, …, n(1)
式中Xi的生产函数Vi+ = Vi+ (X1，…，Xn，Xn+1, …，Xn+m)和消耗函数Vi- = Vi- (X1，…，Xn，Xn+1, …，Xn+m)是所有变量的函数，式（1）用S-系统方程可表达为：
dXi / dt=αi ?n+m j=1Xgijj-βi ?n+m j=1Xhijj i = 1, 2, …, n(2)
式（2）中αi和βi（αi、βi > 0）分别表示生产函数和消耗函数的速率常数，gij和hij分别表示变量Xj在因变量Xi的生产和消耗过程中的动力学阶，其中gij或hij> 0表示Xj在Xi的生产或消耗过程中起"正"调控作用，反之，如果gij或hij< 0则表示Xj在Xi的生产或消耗过程中起“负”调控作用，而当gij或hij= 0时则表示Xj在Xi的生产或消耗过程中不起任何调控作用。
Note: Based on KEGG database (http://www.genome.jp/kegg/)
图1 T细胞受体信号转导途径
为简便起见，本研究以一个范例来概要整个建模过程。图2显示了经典的带有“正” “负”调控作用的信号级联反应过程。级联反应中前体X3、X4通过两步反应（比如磷酸化）衍生出活性产物X1、X2，其中上一级反应产物影响下一级反应。该级联反应由系统输入X5启动，而当终产物X2足够多时，则通过负反馈作用抑制X1的生成，从而整个过程得以减缓。
Note: ? positive regulation; ⊙ negetive regulation
图2 带有反馈的两步级联反应
该过程中X1、X2是因变量，而X3 ～X5则被认为是自变量，其动力学用S-系统方程可表达为：
dX1 / dt=α1Xg122 Xg133 Xg155-β1Xh111
dX2 / dt=α2Xg211 Xg244-β2Xh222 (3)
X3,X4,X5=常数
由于式（3）中前体X3、X4是常数，其对X1、X2生产函数的贡献可以分别归并为速率常数α1、α2，因此为避免估计更多参数，可以不考虑活性产物前体的作用（但又不影响分析结果），式（3）可改写为：
dX1 / dt=α1Xg122 Xg155-β1Xh111
dX2 / dt=α2Xg211 -β2Xh222 (4)
与上述范例类似，本研究对T细胞受体信号途径的动力学模拟一律不考虑活性产物的前体，而只研究活性产物受到的“正”“负”调控作用。事实上，图1所示即是不考虑前体分子的T细胞受体信号转导途径。基于图1，本研究首先出影响每个因变量分子的生产和消耗函数的“正”“负”调控分子，然后依照范例所示建立其S-系统方程。
1.3 参数估计
除了定性的数据，目前还没有文献提供T细胞受体信号转导途径中各分子间相互作用的数量关系。另一方面，本研究并非旨在对该途径的精确定量特征进行模型研究，而只是试图通过建立“数量级模型（order-of-magnitude model）”［2］来阐述模型结构的整个动力学性质，为从系统水平上进一步理解T细胞受体信号转导途径奠定基础。因此，本研究采用前人总结的经验来估计每一过程的速率常数和动力学阶的值。
实际上，对近年来的生化模拟系统所做的近1000次的动力学阶的分析表明，未受调节的过程其动力学阶常位于1或0.5，而受调节的过程其动力学阶通常要小一些。一般来说，“正”调控作用的动力学阶常处于0和1之间，而“负”调控作用的动力学阶常位于0和-0.5之间［2］。本研究对模型中未受调节的过程（一般为单变量）取动力学阶为1；而对于受调节的过程（表现为多个变量），“正”调控作用则采用动力学阶为0.5，“负”调控作用则采用动力学阶为-0.5。
速率常数一般对模型结果不是那么敏感，其大小既与具体的反应过程有关，也取决于时间单位［2］。由于本研究并非精确定量模型，故取各因变量分子的生产和消耗函数的速率常数为1。
各反应分子的初始浓度的确定，本研究采用了“相对浓度”的概念，以避免浓度量纲对模型分析的影响。所谓“相对浓度”，即是指某时刻反应分子的浓度与其达到稳态时的浓度的比值：相对浓度=瞬时浓度/稳态浓度。文中各自变量，由于其为系统外输入，启动或控制系统动力学过程之变量，故保持其相对浓度始终为一常数值1；而对于各因变量，由于皆为信号级联反应过程的产物，故取其相对浓度的初始值为0或无穷小（通常取1.0×10-10以避免模型运行中出现故障）。
1.4 模型运行
通过计算软件Matlab7.0的仿真平台Simulink工具箱对已经建立的T细胞受体信号转导途径的S-系统动力学方程进行模型的搭建、调试和仿真运行。仿真时间的设定以各因变量分子浓度达到其稳态浓度为上限。值得注意的是，由于各因变量分子浓度采用了“相对浓度”，无量纲，而且各因变量分子的生产和消耗函数的速率常数皆取值为1，因此仿真时间也只是一个相对概念，没有量纲。对模型分别进行两方面的研究：模型基本特征的分析；模型的稳定性分析。
2 结果
2.1 PLC-γ1介导的信号途径
2.1.1 CD45 CD45为T细胞中蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）的一个典型代表。研究发现，CD45可调节T细胞活化过程的一些起始关键酶如Lck、Fyn的活性。对于Lck，其催化区含有两个可供调节的酪氨酸残基（tyr394和tyr505），tyr394是一自身磷酸化位点，可通过自身磷酸化作用使Lck激酶活性上调；而tyr505的磷酸化则可使Lck激酶活性下调。当TCR/CD3识别抗原后，已知两种分子参与了tyr505的调节过程：①CD4/CD8胞内段具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性，可以通过介导tyr505的去磷酸化来提高Lck激酶活性；②CD4/CD8和CD45发生共凝集，导致与CD4/CD8分子胞内段相连的Lck的Tyr505位点受到CD45去磷酸化而被激活。同时，CD45也可能导致了与CD3相连的Fyn的酪氨酸残基去磷酸化而被激活［12］。模型结果（图3A）显示，CD45经细胞外分子激活后，活性浓度迅速上升，与共受体CD4/CD8一起通过去磷酸化激活Lck，同时也通过去磷酸化激活Fyn，导致Lck和Fyn的活性浓度迅速上升到高位，从而激活ZAP-70的下游级联。
2.1.2 ZAP-70 研究发现，当抗原或抗体与TCR/CD3特异结合后，CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM）可被已活化的Src家族酪氨酸激酶Lck和Fyn磷酸化，成为SH2结构域的高亲和力结合位点，与含有SH2结构域的蛋白，如蛋白酪氨酸激酶ZAP-70相互结合。同时，由于与TCR/CD3紧邻的CD4/CD8分子的胞浆部分与Lck相联，因此Lck可就近使ZAP-70磷酸化促使其活化［3］，活化的ZAP-70可使含SH2结构域的接头蛋白LAT和SLP-76磷酸化［4］。模型结果显示（图3A～B），TCR/CD3在与抗原或抗体结合后，由于受到Lck和Fyn磷酸化激活，使得其活性浓度迅速升高，从而与ZAP-70相互结合，而结合后的ZAP-70随即被Lck磷酸化而活化，活性浓度也随即上调，ZAP-70进而通过磷酸化而活化其下游分子LAT和SLP-76，导致LAT和SLP-76活性浓度也随之上升。
2.1.3 SLP-76 SLP-76包括一个酸性的N末端区，该区包含三个酪氨酸磷酸化位点（Tyr-113，Tyr-128，Tyr-145）。磷酸化后，这些位点能结合VAV、NCK 和ITK的SH2区［4］。SLP-76中部含有脯氨酸富集区和精氨酸富集区，前者与PLC-γ1组成性结合，后者与GRB2相关的下游接头蛋白GADS关联，从而形成SLP-76信号转导复合体［4］。模型结果也是如此（图3A～C），SLP-76活性浓度的上升导致其募集的分子（包括VAV、NCK、ITK、GADS和PLC-γ1）的浓度增加。
上述信号转导复合体中，ITK主要作用于：①PLC-γ1的激活；②响应TCR刺激，通过激活VAV- Rho/Cdc42途径调节细胞骨架肌动蛋白重组［5］。而NCK 则通过激活PAK参与另外一条途径调节细胞骨架肌动蛋白重组［5］。模型结果显示（图3B～C），活性上调的ITK通过磷酸化分别活化PLC-γ1和VAV，导致两者活性浓度增加，而活化的VAV则促进Rho/Cdc42活性上调；同样，活性上调的NCK 则刺激PAK的活性浓度增加。活性浓度上升的Rho/Cdc42和PAK分别参与调节细胞骨架肌动蛋白的重组。
2.1.4 LAT LAT是一种跨膜支架蛋白，磷酸化的LAT结合三个蛋白分子：GADS、PLC-γ1、GRB2。完成下列功能：①GADS和SLP-76结合到LAT复合体上，促进SLP-76磷酸化；②GRB2连接SOS到LAT复合体上，介导Ras-MAPK途径；③PLC-γ1和LAT结合导致PLC-γ1的磷酸化［4］。模型结果显示（图3B～C），活性上调的LAT导致其募集的分子GADS、PLC-γ1、GRB2的活性浓度增加。需要指出的是，GADS和PLC-γ1的活性上调是LAT、SLP-76和ITK等信号分子共同作用的结果。
2.1.5 PLC-γ1 活化的PLC-γ1重新定位后即可水解胞膜上的底物磷脂酰肌醇二磷酸PIP2, 产生三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DAG）［1］。IP3可开放胞膜Ca2+通道和胞内钙储备，导致胞质内Ca2+浓度升高和依赖于Ca2+/钙调素（CaM）的钙调磷酸酶（CaN）的活化，活化的CaN使转录因子NFAT去磷酸化而被活化，活化的NFAT移入细胞核内与核内多种转录因子协同作用，激活IL-2、IL-4、TNF-α等基因的转录。DAG可使蛋白激酶Cθ（PKCθ）结合到胞膜内侧面，在磷酯酰丝氨酸的协同作用下，PKCθ自身的三个位点被DAG磷酸化后激活［6］。模型结果显示（图3C、3D、3F），随着PLC-γ1活性浓度的上升，IP3 和DAG的浓度也以同样趋势变化。浓度上调的IP3导致Ca2+浓度的上升，进而刺激CaN活性上调，而NFAT也随CaN活性浓度的上升而上升，导致IL-2、IL-4、TNF-α等基因产物的逐渐增加。同时，浓度上调的DAG对PKCθ进行磷酸化，导致后者活性浓度的上升。
2.1.6 NFκB BCL-10、CARMA1和MALT1是PKCθ与NFκB上游调节复合物IKK之间的信号分子，三者通过共有的CARD结构域构成复合物并锚定于TCR/CD3信号复合体附近。活化的PKCθ可激活该复合物，而后者使IKK（α/β/γ）复合物磷酸化而活化，随后IκB丝氨酸残基被IKK复合物磷酸化后经泛素标记而降解，使NFκB 从IκB上释放出来，NFκB移位入核，启动目的基因转录［1］。模型结果表明（图3D、3F），随着PKCθ活性浓度的上升，复合物BCL-10/CARMA1/MALT1的浓度也以同样趋势上升，随后该复合物活化IKK（α/β/γ）复合物导致其活性浓度增加，进而磷酸化IκB，使其磷酸化产物上调，从而使得NFκB 从IκB上释放而活化，而随着NFκB活性浓度的增加，导致IL-2、IL-4、TNF-α等基因产物的逐渐增加。
2.2 Ras-MAPK途径
Ras是位于细胞膜胞质面的GTP结合蛋白，是关键性的细胞生长调节剂。Ras蛋白要释放GDP，结合GTP才能被激活，而GDP的释放需要鸟苷酸交换因子（GEF，如RasGRP1、SOS）参与。RasGRP1只表达于T细胞，成为连接TCR-PLC-γ1-DAG途径和Ras信号途径的中介；SOS则通过接头蛋白GRB2从胞质中移位至细胞膜的胞质面，接近膜结合的Ras，从而活化Ras。Ras活化后可启动下游MAPK信号级联，导致转录因子AP1的活化，从而调节基因表达［7］。模型结果显示（图3D、3F），DAG和SOS分别经上游分子激活后，活性浓度迅速上升，导致关联分子RasGRP1的浓度以同样趋势上升，随后激活Ras，使其活性浓度也随之增加，进而启动MAPK信号级联，使MAPK信号上调，最后激活转录因子AP1，而随着AP1活性浓度的增加，导致IL-2、IL-4、TNF-α等基因产物的逐渐增加。
2.3 PI3K辅助信号途径
肽竞争抑制实验表明，CD28分子聚集后导致其胞浆区基序YMNM中Tyr173的磷酸化，继而结合并激活PI3K［8］。PI3K在胞内主要催化PIP2生成PIP3。下游信号分子AKT的PH结构域与PIP3相互作用，由于两者的高亲和力而使AKT 向胞膜募集，在PDK1催化作用下磷酸化而被充分激活。活化的AKT对COT磷酸化，而COT进而激活NIK，后者使IKK（α/β/γ）复合物磷酸化而活化，随后IκB丝氨酸残基被IKK复合物磷酸化后经泛素标记而降解，使NFκB 从IκB上释放出来，NFκB移位入核，启动目的基因转录［1］。最近发现另外一个共刺激分子ICOS，在ICOS的胞浆区181-184位氨基酸残基之间有一个序列为YMFM的基序，该基序与CD28和CTLA-4胞浆区的YMNM基序类似，也可以通过PI3K向下游传递活化信号［9］。模型结果显示（图3D～F），CD28和ICOS分别经细胞外配体分子激活后，活性浓度迅速上升，导致PI3K的浓度以同样趋势上升，活化的PI3K产生大量PIP3，从而募集AKT和PDK1，随后PDK1使AKT磷酸化而活化，导致AKT活性浓度逐渐增加，进而激活COT和NIK，使其浓度上调，最后通过NIK激活IKK（α/β/γ）复合物导致其活性浓度增加，进而磷酸化IκB，使其磷酸化产物上调，从而使得NFκB 从IκB上释放而活化，而随着NFκB活性浓度的增加，导致IL-2、IL-4、TNF-α等基因产物的逐渐增加。
2.4 抑制性信号途径
2.4.1 CTLA-4和PD-1 为保持免疫应答的平衡，避免过度活化，T细胞的活化过程受抑制性受体信号的调节。与CD28分子具有高度同源性的CTLA-4，其配体也是B7。当T细胞激活后呈上调性表达，该分子与B7结合的亲和力大于CD28分子的20倍，从而竞争性地与APC细胞表达的B7结合，启动抑制性信号［10］。与CTLA-4/B7一样，PD-1/PD-L相互作用亦提供T细胞活化的抑制信号，而且它们都通过SHP1发挥抑制作用［11］。CTLA-4和PD-1胞浆区的ITIM（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）酪氨酸残基磷酸化后可与酪氨酸磷酸酶SHP1羧基端的SH2结构域结合并激活SHP1，SHP1通过脱磷酸作用对信号转导进行负调控。SHP1可使CD3ζ和ZAP-70上磷酸化后的酪氨酸位点脱磷酸而失活，从而抑制TCR信号的级联。从模型结果（图3A）可见，CTLA-4和PD-1分别经细胞外配体分子激活后，活性浓度迅速上升，导致SHP1的浓度以同样趋势上升，而活性上调的SHP1使CD3和ZAP-70活性浓度从高位逐渐下降到稳态值。
2.4.2 CBL 泛素连接酶CBL主要通过介导一系列已活化的酪氨酸激酶的泛素化降解途径来发挥其负性调节作用。实验证实CBL可以下调Lck、Fyn、ZAP-70的活性［1,12］。模型结果（图3A）显示，随着Lck和Fyn的活性浓度迅速上调，受到Lck激活的ZAP-70的活性浓度也迅速上升到高位，随后高活性浓度的Lck、Fyn 和ZAP-70受到CBL介导的泛素化降解途径的抑制，从而使其活性浓度从高位逐渐下降，回归其稳态浓度。
3 讨论
本模型采用S-系统方程来描述，其模型结构具有不变性、简单性的特征，同时，S-系统能够准确有效地处理各种生化系统变量在稳态附近的动态变化。事实上，即使当变量浓度偏离稳态10或100倍时（远大于体内变量典型的变化范围），S-系统方程仍然优于其他系统方程，能够高度准确的进行模拟［2］。本模型对各初始相对浓度在0～100之间的变动范围内对模型进行了稳定性分析。结果表明，当42个因变量分子初始相对浓度在0～100之间单独变化时，在模型仿真的有效时间内，所有42个因变量分子的相对浓度除了中间过程有起伏变化外，最终都回归为1，即回归为其稳态浓度（结果没有在本文显示），这表明本模型结构是稳定的，与真实的T细胞受体信号途径对内外扰动的稳定响应特征相符。
S-系统方程的参数只有两类：速率常数和动力学阶。虽然目前尚不能获取T细胞受体信号途径的相应参数，但这并不能防碍我们通过S-系统模型来分析该途径信号转导的主要特征。事实上，基于以往的经验性参数估计方法，S-系统为我们提供了很好的“数量级模型”来阐述信号转导的整个动力学性质。从上述模拟结果也可看出，所有因变量分子的浓度，不管其中间过程如何变化，最后都回归为稳态浓度，符合典型的生化“自稳”特点，表明本模型的结构和参数估计能够描述T细胞受体信号途径的基本特征，可以作为下一步精确定量模型的基础。
值得注意的是，在模型运行过程中，我们发现ZAP-70的相对浓度的变化要比其他分子表现剧烈得多。如图3A所示，ZAP-70的相对浓度首先出现一个“脉冲”式的快速升高过程，然后逐渐回落到稳态值，并导致其下游与之关联的分子如SLP-76、LAT等也出现类似的动态变化（图3B）。从图1可以发现，ZAP-70是T细胞受体信号转导通路上游的关键“节点”分子，它同时受到“活化（正）”和“ 抑制（负）”调节，但是“正”“负”调节的“力度”却随时间此消彼长。显然，T细胞要完成活化这一生理过程，最初必须使“正”调节处于绝对优势，从而“打通”整个信号通路，而关键“节点”分子活性浓度的迅速上调是“打通”整个信号通路的重要保证。随着信号转导的正常进行，“负”调节的“力度”则逐渐加强，导致“节点”分子浓度的适当下调（回归到稳态值），其结果使得T细胞活化过程在可控的程序下进行。另一方面，上述现象也提示我们，通过动力学模型仿真发现信号通路的某些关键“节点”分子可能是寻找药物分子靶标的一种途径。
另外，本模型的搭建和仿真基于一个“人为”的假定，即T细胞受体信号转导通路的各个途径都是同时“在岗”的。该假定虽然武断，但有助于模型结构的正确搭建和对模型动态基本特征的分析。事实上，通过Simulink仿真平台可以很方便地启动或关闭特定的通路，因此可以灵活运用于今后种种实际的T细胞受体信号途径的研究。
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