HPLC测定荜茇三味散中胡椒碱的含量

               作者：那顺朝克图 王烈群 刘宏婧 白广翠 朱晓宇

【摘要】  目的： 建立荜茇（荜茇、诃子、山楂)三味散中胡椒碱的含量测定的方法。 方法：采用高效液相色谱法测定,色谱柱为Kromasil(C18,5um ,250mm×4.6mm)色谱柱，流动相为甲醇?水(77:23)，检测波长为343nm。 结果： 胡椒碱在进样量6.96ug～1.99ug范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9999,平均回收率为102.9%,RSD为1.4%。结论： HPLC法简单准确,精密度高,分离度良好,可用于荜茇三味散的质量控制。

【关键词】  荜茇 胡椒碱 含量测定 高效液相色谱法

　　Abstract  Objective: To determine the content of piperine in the the long pepper?3 powder. Method: Thecontent of piperine in the long pepper?3 powder was determined by RP?HPLC with Kromasil (C18,5um, 250mm×4.6mm) column at room temperature.The mobile phase was methanol?water (V∶V=77∶23) with a flow rate of 1.0 mL·min-1 and the inject?ing volume was 20μL.The external standard was used and the wavelength of the detector was set at343 nm . Results: The linear range was 6.96ug～1.99ug,and correlation coefficient was 0.9999.The average recovery and the relative standard deviation were 103.7%and1.1%,respectively. Conclusion: The method is simple,accurate,and can be used for the quality control of long pepper?3 powder.
   
　　Key words   long pepper;  piperine;  content determination ;  HPLC  

　　本品为蒙药荜茇、诃子和山楂三味药材组成的散剂,是一个蒙医验方，此方具有降血脂的作用且临床应用效果好［1］。方中荜茇具有温中散寒、下气止痛之功效。荜茇的主要成分为胡椒碱,但蒙药荜茇三味散中胡椒碱的含量测定未见报道。为做进一步的研究和开发，故《药典》2005版第一部荜茇中胡椒碱的含量测定方法建立了荜茇三味散中胡椒碱的反相高效液相色谱测定法。结果表明,此法操作简便、灵敏度高、重现性好,为有效控制产品质量提供依据。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器

    依利特P?230型高效液相色谱仪（大连依利特仪器有限公司）包括：UV230+紫外可见检测器，P?230高压恒流泵，EC2000色谱工作站；AL?204天平；溶剂过滤器；AS?3120型超声振荡仪(220V、120W)。

　　1.2  试药

    胡椒碱对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号0775?200203)；荜茇三味散 (由内蒙古蒙药研究院提供)；甲醇为色谱纯试剂。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件

    色谱柱：Kromasil( C18,5um,250mm×460mm)色谱柱;流动相:甲醇?水(V:V=77:23);流速:1.0ml/min；进样量：20ul;检测波长：343nm;柱温：室温。

　　2.2  测定波长的选择

    参考药典(中国药典2005版一部) 荜茇中胡椒碱HPLC法含量测定检测波长在343nm处有最大吸收，故将测定波长确定为343nm［2］。

　　2.3  流动相的选择

    参考中国药典2005版一部的色谱条件，以甲醇?水(77:23)为流动相，结果胡椒碱与其它组分能有效分离，故选择流动相甲醇?水（77：23）为流动相。

　　2.4  对照品溶液制备

    精密称取胡椒碱对照品适量，置50 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀，制成每1ml含0.4432mg胡椒碱的溶液作为对照品溶液。

　　2.5  供试品溶液的制备

    称取荜茇、山楂、诃子粉末各3g(捣碎,过120目筛),混合均匀后,精密称取荜茇三味散粉末1g,置于50ml量瓶中,加入甲醇适量,密塞,超声处理10分钟,放冷,用甲醇补液至刻度,摇匀放置片刻，取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

　　2.6  阴性对照试验

    按处方(不含荜茇药材)及制备工艺,制备空白样品,称取山楂、诃子粉末各3g(经捣碎,过120目筛),混合均匀后,称取混合粉末1g,精密称定,置50ml量瓶中,加入甲醇适量,密塞, 超声处理10分钟,放冷,用甲醇补液至刻度,摇匀放置片刻，取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液作为空白溶液，进样20ul,记录色谱图,结果表明阴性样品溶液在胡椒碱出峰处没有干扰峰出现。见图1～3。

　　2.7  标准曲线的绘制

    将胡椒碱对照品溶液(0.4432mg/ml)依次精密吸取8ml,7ml,6ml,3ml,2ml分别置于5个10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度配制成浓度依次为0.35mg/ml,0.3mg/ml,0.25mg/ml,0.15mg/ml,0.1mg/ml等5份溶液，分别取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，各取样20ul, 注入液相色谱仪,记录色谱峰面积(以峰面积为纵坐标,以对照品浓度为横坐标,绘制标准曲线)回归方程 Y(c)=［9.8742e-006］A+［-8.061457e-003］，r=0.9999，结果表明胡椒碱进样量在6.96ug～1.99ug范围内时与峰面积呈良好的线性关系。

　　2.8  精密度试验

    精密吸取上述供试品溶液用微孔滤膜（0.45μm）过滤,取样20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积,连续进样5次,实验结果表明样品的精密度良好，见表1。

　　2.9  稳定性试验

    取同一样品的溶液分别于0，1，2，4，6，8，12h进行测定，记录色谱峰面积，结果在12h内峰面积无明显变化，RSD为0.66%，见表2。表1  精密度试验结果（略）表2  稳定性试验结果（略）

　　2.10  重复性试验

    取同一批号样品, 精密称定荜茇三味散1g,置50ml量瓶中,加入甲醇适量,密塞,超声处理10分钟,放冷,用甲醇补液至刻度,摇匀放置片刻，取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，按此方法制备5份供试品溶液,分别精密吸取供试品溶液20ul进样,记录色谱峰面积,计算RSD为0.56%。见表3。
表3  重复性试验结果 （略）
  
　　2.11  加样回收率试验

    精密称取同一批号样品约0.5g,共5份,分别置50ml量瓶中,加入胡椒碱对照品溶液(0.4014mg/ml)12ml,再加入甲醇适量,密塞,超声处理10分钟,放冷,用甲醇补液至刻度,摇匀,放置片刻。取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，分别进样20ul，测定色谱峰面积,计算回收率,平均回收率为102.9%,RSD为1.4%。见表4。表4  加样回收率试验结果（略）

　　3  讨论

    蒙药荜茇三味散是由荜茇、诃子和山楂三味药材组成，其中荜茇为主要药材，荜茇的主要成分为胡椒碱。为更好分离该成分，在实验过程中对样品前处理上，对超声时间做以分析筛选，曾比较了超声10、20、30分钟时的样品，样品测定结果认为10分钟超声处理样品所测含量值最高，出现的杂质干扰峰最少，故选择在AS?3120型超声振荡仪上超声处理10分钟。本实验结果表明,在此色谱条件下,采用高效液相色谱法测定三味散剂中胡椒碱的含量,方法简便快速,重现性好，可用于荜茇三味散的质量控制。对该药物其他成分的考察和质量控制尚待进一步深入分析研究。

【】
  　　1 仓都古仁.实用蒙药学. 内蒙古人民出版社，1987，59.

　　2 国家药典委员会.药典一部 .北京化学出版社,2005，305.