N?乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠环氧合酶?2的影响

【摘要】  目的： 探讨N?乙酰半胱氨酸(NAC)对急性肺损伤(ALI) 大鼠环氧合酶?2 (COX?2)的影响,进一步研究N?乙酰半胱氨酸对急性肺损伤(ALI)肺组织的保护作用。方法： 应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用N?乙酰半胱氨酸进行干预。实验设对照组、模型组、N?乙酰半胱氨酸组，在肺损伤模型成功后24 h处死大鼠,取左叶肺组织。采用免疫组化染色, 检测N?乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠肺组织中COX?2的表达, 利用HPIAS?2000图像分析系统测定COX?2在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：实验对照组肺组织中COX?2的表达较低；模型组肺组织中COX?2的表达高；N?乙酰半胱氨酸组肺组织中COX?2表达较低。经q 检验，实验对照组与模型组之间，COX?2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01﹚，实验对照组与N?乙酰半胱氨酸组之间，COX?2的平均光密度及阳性面积率差异无显著性(P＞0.05)。结论： N?乙酰半胱氨酸可以减轻肺损伤的程度，对急性肺损伤组织具有重要的保护作用。

【关键词】  N?乙酰半胱氨酸 肺损伤 环氧合酶?2 (COX?2)

　急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是一种肺部过度炎症反应,以肺泡毛细血管膜损伤、通透性增加、肺水肿,炎性细胞浸润和严重气体交换障碍为主要特征［1］。N?乙酰半胱氨酸(NAC)是左旋精氨酸的天然衍生物,是一种含活性巯基化合物［2］。近年国内外大量实验研究结果已经证明,具有强大的抗氧化和细胞保护作用。
   
　　但有关NAC对急性肺损伤炎性细胞因子影响的研究尚少。我们应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用NAC进行干预，观察急性肺损伤大鼠肺组织中COX?2的表达，进一步探讨NAC在防治急性肺损伤中的作用机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  动物模型制备及分组

    健康Wistar大鼠60只（雌雄不拘）, 清洁级（SPF），平均体重(180±35)g，由武汉大学实验动物中心提供。试验前禁食12h, 自由饮水。实验分组分为3组：实验设对照组（注射等量生理盐水，n=20）、模型组（经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg，n=20)、NAC组（于尾静脉注射LPS前1 h分别经腹腔注射NAC(200 mg/kg)，n=20）。称重后, 7%水合氯醛5ml/kg 腹腔注射麻醉, 仰卧固定, 模型组消毒后经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg。

　　1.2  动物标本制备

    将各组动物处死，收集肺组织标本，进行组织学及免疫组织化学标本制作。取材时间为LPS注射后24h(T24)。

　　2  主要试剂
 
    浓缩型兔抗鼠COX?2多克隆抗体(武汉博士德生物技术公司)；超敏即用型S?P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

　　2.1  主要仪器

    YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安器材厂生产；家用高压锅。

　　3  方法

　　3.1  常规HE染色

    取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。

　　3.2  免疫组织化学S?P法检测COX?2相关抗原
 
    主要步骤：

    ① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；

    ② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；

    ③ COX?2采用微波抗原修复（3档，10 min），采用高压抗原修复PBS洗4×5min；

    ④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；

    ⑤ 一抗37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；

    ⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；

    ⑦ 链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；

    ⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；

    ⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。

    用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　3.3  免疫组织化学结果判断 

    COX?2相关抗原以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。
   
　　采用HPIAS?2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对COX?2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定COX?2每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。

　　3.4  统计学处理

    对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK?q检验，检验水准α为0.05。

　　4  结果

    COX?2的表达： 对照组肺组织内可见少量的棕黄色颗粒, COX?2呈低表达；模型组肺组织内可见密集分布的棕黄色颗粒,COX?2呈高表达；NAC组肺肺组织内可见少量的棕黄色颗粒, COX?2呈低表达。图像分析结果显示：对照组COX?2表达的平均光密度为0.0851±0.0332；模型组COX?2表达的平均光密度为0.3349±0.0524；NAC组COX?2表达的平均光密度为0.0765±0.0357。对照组COX?2表达的阳性面积率0.0879±0.0223；模型组COX?2表达的阳性面积率为0.2840±0.0457；NAC组COX?2表达的阳性面积率为0.0942±0.0247。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01﹚。经q 检验，对照组与模型组，模型组与NAC组之间，COX?2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01﹚；对照组与NAC组之间，COX?2的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05) 。见表1。表1  对照组、模型组及NAC组COX?2表达的平均光密度和阳性面积率（略）注：*  对照组与模型组比较，P＜0.01；#    模型组与NAC组比较，P＜0.01；**   NAC组与对照组比较，P＞0.05。

　　5  讨论

    急性肺损伤(ALI)是各种致病因素导致的急性进行性呼吸衰竭,严重的急性肺损伤被定义为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。目前认为肺内炎性因子和抗炎因子的平衡失调导致ALI发生［3］。
   
　　NAC是左旋精氨酸的天然衍生物,分子式为C5H9NO3S,是一种含活性巯基化合物。近年国内外大量实验研究结果已经证明,NAC具有强大的抗氧化和细胞保护作用。NAC可通过两种机制发挥其抗氧化功能:通过发挥还原型谷胱甘肽(GSH)前体即半胱氨酸的功能间接起到抗氧化作用,这是NAC发挥抗氧化作用的主要机［4］;同时,NAC还可以通过提高白细胞内还原巯基水平,抑制白细胞激活和炎症介质的产生,保护抗蛋白酶免于被氧化失活［5］。NAC本身也是一种直接的抗氧化物质,通过自身巯基的氧化来还原生物大分子中的二硫键,从而保护生物大分子的活性,NAC还可以通过补充细胞内的GSH发挥细胞保护作用［6］。前列腺素是一类重要的炎症介质,在ALI中,前列腺素具有增加气道阻力,降低肺顺应性,升高肺动脉压,增加血管通透性等作用,参与ALI的发病［7］。环氧化酶(COX)又称前列腺素合酶,是由花生四烯酸合成前列腺素的限速酶。COX有2种类型同功酶: COX?1即组成型环氧化酶, COX?2即诱生型环氧化酶。有研究表明COX?2与炎症发生发展关系密切,是炎症形成的原因之一［8］。
   
　　本研究结果显示:正常组COX?2呈低表达, 模型组COX?2呈高表达, NAC组COX?2呈低表达。以上结果提示，NAC通过下调COX?2的表达、清除氧自由基、改善钙超载等机制可发挥对复氧性损伤的保护作用, 从而达到对ALI的保护作用。因此,NAC为临床上ALI提供了更有效的方法,并为预防肺功能衰竭提供新的途径,也为ALI的保护开拓了广阔的前景。

【】
  　1 Ware L B, Matthay M A. The acute respiratory distress syndrome.N Engl J Med,2000,342(18):1334～1349.

　　2 李燕芹,吕寒冰,方马荣,等.急性肺损伤时肺部纤维化及血管生成状态的研究.危重病急救医学,2004,16(11):677～678.

　　3 周长福,李志军,刘红栓.血必净联合前列腺素E1对肺纤维化大鼠转化生长因子?β1的影响.中国中西医结合急救杂志,2007,14(3):186.

　　4 余维巍,刘晓晴.肝细胞生长因子在急性肺损伤中的修复作用.中国急救医学,2005,25(6):444～445.

　　5 Jablonski E M , Webb A N , McConnell N A , et al. Plasma membrane aquaporin activity can affect the rate of apoptosis but is inhibited after apoptotic volume decrease. Am J Physiol Cell Physiol,2004,286: 975 ～985.

　　6 Leme A S,Lichtenstein A,Arantes?Costa F M,et al.Acute lung injury in experimental pancreatitis in rats: pulmonary protective effects of crotapotin and N?acetylcysteine.Shock,2002,18(5):428～433.

　　7 Paterson R L,Galley H F,Webster N R,et al.The effect of N?acetylcysteine on nuclear factor-kappaB activation,interleukin?6, interleukin?8, and intercellular adhesion molecule?1 expression in patients with sepsis.Am J Crit Care Med,2003,31(11):2574～2578.