用HPLC法测定鸡血藤膏中芒柄花素的含量

【摘要】  目的：采用高效液相色谱测定鸡血藤中有效成分芒柄花素的含量。方法 ： 按高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合 硅胶为填充剂，乙腈-水（33：67）为流动相，检测波长250nm，柱温为35℃，流速1.0ml／min；进样量10μl，理论板数按芒柄花素峰应不低于5000。结果：制剂中的辅料对主药测定无干扰。芒柄花素在进样量为0.01025μg～0.5125μg(进样量10μl)范围内呈良好线性关系。精密度RSD为0.2%，供试品溶液在10小时内稳定。测得回收率平均值为98.73%,RSD为0.24%，表明方法回收率符合相关规定。结论：该法简便，迅速，准确，专属性强。

【关键词】  鸡血藤； 高效液相色谱法； 含量测定； 有关物质

鸡血藤膏主要用于补血活血，舒筋活络，可腰膝酸痛、肢体麻木、风湿麻痹、经闭、痛经、月经不调等［1］。本研究采用高效液相色谱法测定其中一个有效成分芒柄花素的含量，方法简便，迅速，准确，专属性强。

    1  仪器、试药与实验样品

    高效液相色谱仪      DIONEX液相色谱仪 ULTIMAT 3000；天平                AG135和BS210S（梅特勒-托利多）；紫外分光度计        UV-500（英国热电）；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余所用试剂均为分析纯。芒柄花素对照品（批号：111703-200501）为药品生物制品检定所提供。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件与系统适用性试验

    以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水（33：67）为流动相，检测波长250nm，柱温为30℃，理论板数按芒柄花素峰计算应不低于3000。

    2.2  方法

    按高效液相色谱法测定（中华人民共和国药典2005年版一部附录Ⅵ D）。

    2.3  对照品溶液制备

    取芒柄花素对照品适量，精密称定，用甲醇制成5μg/ml的溶液，即得。

    供试品溶液制备  精密量取本品25ml，用乙酸乙酯振摇提取5次，每次30ml，合并乙酸乙酯提取液，挥干溶剂，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

    测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl［2］，注入液相色谱仪，测定，即得。

    本品每1ml含鸡血藤以芒柄花素（C16H12O4）计，不得少于5μg。

    2.4  鸡血藤片中芒柄花素含量测定数据，见表1。

    3  含量测定方法学考察

    3.1  方法依据

    按中华人民共和国药典2005年版一部附录Ⅵ D。

    3.2  方法学考察

    3.2.1  光谱扫描及检测波长的确定  取芒柄花素对照品适量，用甲醇制成对照品溶液［3］，在紫外可见分光光度计上于200～400nm扫描，最大吸收波长为250.0nm。

    3.2.2  提取方法考察  乙酸乙酯提取次数考察：分别取本品25ml,同正文方法提取，分别用乙酸乙酯提取3次，4次，5次，6次，比较峰面积，结果见表2。表1  三厂家鸡血藤片中芒柄花素含量表2  萃取次数与峰面积 结果表明，用乙酸乙酯提取5次可提取完全。 

    3.2.3  干扰试验  供试品溶液制备：精密量取本品25ml，用乙酸乙酯振摇提取5次，每次20ml，合并乙酸乙酯提取液，挥干溶剂，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

    对照品溶液制备：取芒柄花素对照品适量，精密称定，用甲醇制成5.125μg/ml的溶液，即得。

    阴性对照溶液制备：取缺鸡血藤的阴性对照样品，照供试品溶液制备方法制备，即得。

    吸取上述三种溶液各10ul，按含量测定方法进行测定，结果在阴性对照溶液色谱图中，在芒柄花素峰位置处无干扰色谱峰，见图1～3。

    3.2.4  线性关系  取芒柄花素对照品适量，加甲醇制成系列浓度对照品溶液（μg/ml ：1.025、2.05、5.125、10.25、20.5、25.625、51.25）。照含量测定项下测定峰面积［4］，测定数据见表3。

    以芒柄花素浓度对峰面积进行线性回归，得回归方程 ： Y=1.04X  -0.401，r=1.000，  芒柄花素在进样量为0.01025μg～0.5125μg(进样量10μl)范围内呈良好线性关系。见图4。

    3.2.5  稳定性试验  取供试品溶液（批号：200608001），照供试品制备方法供试品溶液。

    按含量测定项下方法在0小时、1小时、2小时、3小时、5小时、8小时、10小时进样进行峰面积测定［5］，见表4。测定结果RSD为0.2%，供试品溶液在10小时内稳定。

    3.2.6  重复性试验  对同一批鸡血藤膏（批号：李时珍药业200608001），取6份，照含量测定方法进行测定，见表5。结果表明，该方法重现性良好。

    范围选取低限40%处做重现性和回收测定(样品：武汉中联药业050600 取样20ml），结果见表6。

    选取限度的1倍处做重现性和回收率测定（样品：武汉中联药业050600，取样80ml），结果见表7。

    3.2.7  回收率试验

    取已知芒柄花素含量的鸡血藤膏（批号：李时珍药业200608001，含量为1.481ug/ml）6份，每份25.0ml，分别加入芒柄花素对照品40.5ug，按含量测定项下测定，见表8。测得回收率平均值为98.73%,RSD为0.24%，表明方法回收率符合相关规定。表4  芒柄花素测定稳定性试验测定数据表5  芒柄花素含量测定重复性试验测定数据表6  重现性结果表7  重现性和回收率测定 表8  芒柄花素回收率试验测定数据  

    4  讨论

    我们对标准品溶液在200～400nm范围内进行紫外扫描,结果发现在250nm处有最大吸收,故选择此波长为检测波长。

    在试验中，曾选择以甲醇-水（65：35），乙腈-水（45：55），比较发现，以正文中采用的乙腈-水（33：67）作为流动相的色谱分离度最佳，故采用。

    本方法检测有效成分芒柄花素简便，迅速，准确，专属性强。

【】
  1 中华人民共和国药典委员会.药典.一部.北京:化学出版社,2005，212～213.

2 胡芳弟,封士兰,赵键雄.RP-HPLC法测定红芪中两种异黄酮类成分的含量.中药材,2003,26(9):634.

3 李伟东,阚毓铭.刺果甘草化学成分的研究.南京中医药大学学报,2006,16(4):223～224.

4 田薇,张大华,程型国,等.高效液相色谱/质谱分析抱茎獐牙菜提取中的苷性成分.分析化学(研究简报),2005,33(9):1265～1268.

5 海力茜,张烜,徐建军,等.HPLC测定新疆红芪中芒柄花素的含量.华西药学杂志,2005,20(5):433.