HT036是纤维化相关基因P311的相互作用蛋白
作者：彭旭，谭江琳，袁顺宗，贺伟峰，陈烯伟，罗高兴，吴军
【摘要】 目的 利用激光共聚焦显微镜观察未知蛋白(HT036)与纤维化相关蛋白(P311)的细胞内表达与共定位。方法 构建带绿色荧光的HT036真核表达载体，经鉴定正确后，与前期构建带红色荧光的P311真核表达载体共转染人胚肾上皮细胞株(HEK293)，同时共转染空载体做对照，激光共聚焦显微镜下观察蛋白在细胞内表达、分布和共定位。结果 HT036真核表达载体经聚合酶链反应(PCR)、双酶切和测序鉴定正确，与P311共转染HEK293细胞后，激光共聚焦显微镜观察到绿色和红色荧光表达。HT036和P311主要分布在细胞胞浆，两者在HEK293细胞中存在共定位，而对照组则无该现象。结论 通过酵母双杂交筛选出的P311相互作用蛋白HT036，在活体细胞内存在空间上的共定位，进一步证明它们之间的相互作用，为探讨P311纤维化机制提供新的切入点。
【关键词】 创伤修复;蛋白;基因;成纤维细胞;瘢痕
Abstract: Objective To observe the intracellular expression and the co?location of HT036 with P311 in human embryo kidney cell line.Methods The encoding sequence of HT036 was amplified and cloned into the eukaryotic expression plasmid pEGFP?N2.The construction was verified by sequencing and then co?transfected into HEK293 with pDsRed?P311.The expression products were visualized and analyzed by confocal microscope.Results The vector was successfully constructed.The confocal microscope scanning showed that the fluorescence fusion proteins mainly distributed in cytoplasm and there was co?location between the two proteins.Conclusion This study further confirmes the issue that HT036 and P311 may interact with each other in vitro and play role in hypertrophic scar formation.
Key words:trauma repair;protein;gene;fibroblast;scar
创伤修复过程中,由于全身和局部因素的影响，常可导致以细胞外基质过度沉积为特征的增生性瘢痕。它是一类特发于人类的增生性疾病，由于发病机制的多样性和理想动物模型的缺乏，至今仍是创伤修复领域研究的难点和热点。纤维化相关蛋白(P311)基因是本研究小组利用基因芯片技术从早期增生性瘢痕组织中筛选出的显著高表达差异基因[1]，研究发现P311基因参与神经元损伤修复和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程[2，3]。为了进一步探讨P311基因在创伤修复过程中,尤其是增生性瘢痕发生中的作用机制及可能存在的上下游调控模式，我们利用酵母双杂交系统筛选了人肝cDNA文库，得到了其中能与P311相互作用的HT036蛋白[4]。HT036为一未知功能蛋白，国内外鲜有报道。人胚肾293细胞作为最常用的工具细胞，具有表达稳定和易转染特性。本实验通过构建带绿色荧光的HT036融合表达载体，与前期构建的带红色荧光的P311融合表达载体共转染人胚肾293细胞，验证HT036与P311之间的相互作用。
材料与方法
1 主要材料和试剂
HEK293细胞、含HT036编码基因重组载体pACT2?HT036、大肠杆菌菌株DH5、含绿色和红色pEGFP?N2和pDsRed?N1真核表达载体(本室保存)。P311红色荧光融合蛋白表达载体(pDsRed?p311)(本室袁顺宗博士构建并保存)。凝胶回收试剂盒(V?gene产品);质粒提取试剂盒(Omega产品);限制性核酸内切酶EcoRⅠ和SalⅠ 、T4DNA连接酶、PCR反应试剂盒(大连宝生物公司);DMEM和小牛血清(Gibco公司);脂质体Lipofetamine 2000(Invitrogen公司);多聚赖氨酸(Sigma公司);其它常规化学试剂为国产分析纯以上产品。
2 方法
2.1 引物 根据HT036序列和pEGFP?N2载体酶切位点设计引物，在每条引物的5’端引入相应的限制性酶切位点及保护性碱基。引物由上海鼎安生物公司合成，引物序列如下：
上游引物：5’?GCGAATTCATGGGGCTGGGGGCCGTCC ?3’
EcoRⅠ
下游引物：5’?CAGGATCCCCTGGCCAGCCTCTGGGTGGC ?3'
SaLⅠ
2.2 模板 以本室前期酵母双杂交系统筛选出的阳性克隆重组载体pACT2?HT036为模板。
2.3 PCR扩增 50μl反应体系组成：10×PCR buffer 5μl,25mM MgCl2 3μl,2.5mM dNTP 1μl, rTaq酶1μl,引物各0.5μl,DNA模板1μl,ddH2O 38μl。扩增程序为：94℃预变性5分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，共30循环，最后72℃延伸10分钟。
2.4 PCR产物纯化与回收 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，于长波下快速切取630bp左右目的条带，再用DNA凝胶回收试剂盒回收，回收产物经紫外分光光度计测定纯度和浓度。
2.5 pEGFP?HT036表达载体构建 将凝胶回收产物和pEGFP?N2分别用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳并回收纯化，T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取克隆经PCR和双酶切初步鉴定正确后送上海生工公司测序确证。
2.6 细胞培养和转染 HEK293细胞采用常规培养，转染前夜将HEK293细胞按5×105个/孔接种至放置有多聚赖氨酸处理的盖玻片的6孔培养板中，待细胞至90%融合时共转染pDsRed?P311和pEGFP?HT036，以pDsRed?N1和pEGFP?N2共转染作为对照组。具体方法为：(1)将4ugDNA用250μl无抗无血清DMEM稀释并混匀后，室温孵育5分钟;(2)用250μl无抗无血清DMEM稀释10μl Lipofectamine2000并混匀后，室温孵育5分钟;(3)将(2)加入(1)中并轻柔混合，室温孵育15分钟;(4)将混合后的液体加入含2ml无抗10%小牛血清DMEM培养基六孔板并轻柔混匀，置于37℃，5%CO2培养;(5)4小时后，弃去培养基，换用含10%小牛血清的DMEM继续培养。
2.7 激光共聚焦观察 转染后48小时，取出盖玻片，以PBS小心清洗表面1次，将其置于载玻片上，采用甘油封片。然后分别以488nm(激发绿色荧光)和558nm(激发红色荧光)为激发波长，在激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 510 META)下观察HT036和P311在HEK293细胞内表达分布与相互间的共定位。
结 果
1 pEGFP?HT036重组载体PCR及酶切鉴定
将连接产物转化大肠杆菌DH5α后，于卡那抗性细菌培养板(LB)培养平板上挑取单个菌落，进行PCR和酶切筛选表达HT036基因的阳性菌落。结果显示3个菌落均为阳性菌落。结果见图1、2。
2 pEGFP?HT036重组质粒测序鉴定
测序结果经与Genebank(序列号BC006140.1)序列比对，结果在第402位有一个碱基不一样(T变为C),但处于三联密码子的第3位，不影响蛋白翻译。结果见图3。
3 HT036与P311的表达与共定位
pDsRed?P311和pEGFP?HT036共转染HEK293细胞48小时后，分别以488nm(观察绿色荧光)和558nm(观察红色荧光)为激发波长，利用激光共聚焦显微镜的CH3?T1(BP 505～550nm)和CH3?T2(LP 560nm)通道可分别检测到融合蛋白EGFP?HT036和DsRed?P311发出的绿色荧光和红色荧光(图4a、b)。从荧光分布可以看出，P311和HT036主要表达于细胞质中，在细胞核也有少量表达。并且二者具有共定位(图4c)。而共转染对照组可见绿色和红色荧光(图5a、b)，却没有细胞内的共定位(图5c)。
讨 论
烧伤后增生性瘢痕的发生机制尚不清楚，组织学上以成纤维细胞的过度增生和细胞外基质的过度聚集为特征[5]。细胞外基质、成纤维细胞和细胞因子是研究的热点。人转化生长因子β(TGF?β)是目前公认的最强致纤维化细胞因子。TGF?β不但促进创面单核巨噬细胞浸润、促进成纤维细胞向伤口迁移、增殖与胶原合成，而且刺激伤口成纤维细胞、单核巨噬细胞自分泌产生TGF?β，形成正反馈刺激作用，最终导致成纤维细胞产生大量的胶原。TGF?β还可以通过减少创面胶原酶表达而抑制胶原降解。此外，TGF?β还可以作用于下游的结缔组织生长因子起到信号放大作用[6]。Wnt信号通路在胚胎发育、细胞增殖和肿瘤发生当中起重要作用，研究同时发现，该信号通路亦参与组织的修复和纤维化，在许多纤维化疾病如肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化中有Wnt通路的异常[7]。P311基因作为新发现的不同于TGF?β信号分子，其生物学功能也逐渐被报道：2002年Desi Pan等发现P311基因可以促进小鼠成纤维细胞株细胞NIH3T3和C3H10发生肌成纤维细胞细胞样细胞转化，并可以影响其所分泌的TGF?β表达[2]。2004年Masashi等发现，成年大鼠面神经损伤后，损伤神经的神经元细胞中P311基因表达显著增加;腺病毒介导P311基因转染可以促进损伤面神经的轴突再生[3]。2006年Shi等[8]发现P311通过激活Ral A激酶诱导肌成纤维细胞阿米巴样运动。
我们在基因芯片发现早期增生性瘢痕中p311基因表达显著差异后，通过构建P311诱饵表达载体，利用酵母双杂交系统筛选出与之相互作用蛋白HT036。HT036蛋白很可能是目前存在于哺乳动物细胞内的结构、功能未知的一种新蛋白，有可能与P311和内皮抑制素的作用机制有关[9]。最新NCBI蛋白序列比对提示HT036又名羟基丙酮酸异构酶同系物，而羟基丙酮酸异构酶在乙醛酸代谢通路中能特异性催化羟基丙二酸半醛向羟基丙酮酸转化，最后经由丝氨酸转变为丙酮酸盐[10，11]。但是HT036和P311蛋白之间的相互作用，在增生性瘢痕的形成中起什么样的作用?这些都是值得我们下一步深入探讨的问题。
本实验在克隆了HT036编码序列后，构建至带绿色荧光的真核表达载体pEGFP?N2中，与前期构建的带红色荧光的P311真核表达载体共转染HEK293细胞，共聚焦显微镜下观察发现HT036和P311在空间上存在共定位，进一步验证了酵母双杂交的结果，为后续P311信号通路的研究提供新的思路。
【】
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