人体正中神经内部显微结构的三维重建与可视化研究

                     作者：孙廓,胡平,张峰,张键,李华

【摘要】  ［目的］探索应用机处理人体正中神经全长连续冰冻组织切片的二维图像信息，开发3DNerve神经三维可视化系统，重建人体正中神经内部显微结构并实现三维可视化。［方法］取新鲜人尸正中神经标本1例，以人长发为定位线、OCT包埋剂包埋、采用连续冰冻组织切片、乙酰胆碱脂酶组织化学法染色、高分辨率扫描仪获取二维数码信息后、应用3DNerve对正中神经显微结构进行三维重建。［结果］正中神经在不同断面神经束的数目、位置以及神经束内神经纤维的性质变化较大。连续断面观察显示各神经束均是混合束，未见有纯粹的感觉束或运动束的出现。通过3D Nerve可在任意断面放大的视野下观察正中神经的显微结构，追踪各神经束在正中神经内的立体行径。从而动态地展示正中神经内部神经束的复杂结构。［结论］重建的正中神经三维可视化真实地再现正中神经干全长及其内部各神经束和束组的三维立体结构，可为临床修复正中神经损伤提供精确的断层解剖图像。

【关键词】  正中神经； 三维重建； 三维可视化； 乙酰胆碱脂酶

    Abstract：［Objective］To explore the application of computer in dealing with two?dimensional image information of human median nerve series freezing tissue sections, in order to develop nerve three?dimensional visualization system (3D Nerve) , and finally to reconstruct 3D internal microstructure of human median nerve and realize  3D visualization.［Method］One fresh cadaver median nerve was taken, located with human hair and embedded in OCT.  Series freezing tissue sections were made and  stained with  ACHE histochemistry method, and 2D image information was obtained through high resolution scanner. Microstructure of median nerve was finally reconstructed with 3D Nerve.［Result］Different cross sections of median nerve had quite different number and positions of fasciculi.  In addition, characters of fasciculus' s internal nerve fiber were  also quite different.Scross sections observation showed that all fasciculi were mixed fasciculi. With the 3D Nerve, the microstructure of median nerve was able to be observed in magnifying visual field at any cross section,  and the tracking  of stereo course of fasciculi  in median nerve became possible.［Conclusion］Reconstructed 3D visualization can  reveal the whole microstructure of median nerve and the three dimensional stereo?structure of fasciculi and fasciculus groups exactly and truly. It  can  provide exact topographic atlas and facilitate   precise clixical repair of median nerve injury.

    Key words：median nerve;  three?dimensional reconstruction;   three?dimensional visualization;  acetylcholinesterase

    尽管显微外科技术不断进步，正中神经损伤后修复的结果仍然难以预料和满意。其中重要原因是不能分辨运动和感觉神经束支［1］。由于神经纤维不是始终沿着某一神经束行走，而是在束间互相穿插移行，呈丛状反复交叉，使神经束的大小、数目和位置不断发生变化。因此迫切需要一个精确真实的正中神经内部显微结构的三维立体图谱。

    目前正中神经显微结构的三维重建研究国内外报道均极少。1945年Sunderland［2］通过大体解剖学和组织学方法描述了神经内部结构复杂的束型变化，并绘制了神经断面的二维分布图。据Sunderland的研究，甚至相距0.8 mm，神经的局部排列已有差异。1980年Jabaley［3］描绘出正中神经远端的一幅三维概念图，发现在正中神经的远端，束型在较长段内保持稳定。1984年Terzis［4］在实体解剖和组织学切片的基础上建立了正中神经的三维模型。1991年Greg P.Watchmaker［5］等对前臂远段及手部的正中神经进行连续组织切片邢染色后，应用开发的软件进行图像识别和统计处理并通过三维构建的方法进行了神经束交错变化特征的研究。但是这些以结构研究为目的的三维构建仍然缺乏临床的实用性。2006年Meek MF［6］等采用磁共振DTI技术来重建在体正中神经，但其只能显示正中神经主干的走形，无法更进一步显示正中神经内部结构的显微图像。

    本研究基于正中神经连续冰冻组织切片的二维图像信息，制备成正中神经从其起始处到腕部连续的染色前、后神经断面的二维图像信息数据库，并根据该数据库实现了一个具备神经三维可视化全套功能的3D Nerve神经三维可视化软件系统，逼真地重现了包括正中神经结构信息的三维立体图谱，为临床上正中神经损伤修复方式的选择提供有益帮助，同时对组织工程化的人工神经的仿生构建也具有意义。

    1  材料与方法

    1.1  标本准备

    获取自愿捐献尸体的成人新鲜左侧正中神经标本1例(从内、外侧根组成正中神经处至桡骨茎突，长约47 cm)。将其固定在自行设计的支架上，用4根人长发(直径约80 μm)等距离平行地固定在标本四周作为定位线，然后用OCT包埋剂将标本与定位线一起包埋，液氮速冻。

    1.2    连续组织切片

    将正中神经作连续冰冻组织切片(LEICA  CM1850型冰冻切片机)，切片厚度20 μm，切片间距为100 μm，共切取4650张切片。

    1.3  染色前的切片扫描

    为了防止因切片在染色后的定位点丢失或移位而导致重建的困难，染色前先以2 400 dpi的分辨率对原始图像进行扫描(Epson 4990型扫描仪)，以便染色前、后图像上的定位点的对比配准，以保证定位点的准确性。

    1.4  切片染色

    将切片用乙酰胆碱脂酶(acetylcholinesterase, AChe)组织化学法进行染色，24 h即可。

    1.5    图像获取

    将染色后的切片以2 400 dpi的分辨率进行扫描，同时将所得JPEG格式的图像输入计算机。采用Photoshop CS 29.0将染色前、后的图像进行定位点的比对，以保证定位点的原始可靠性。然后对图像进行边缘锐化、图像增强，去除噪声等二维处理，使图像在进行轮廓分割时更易于识别。

    1.6  三维重建于可视化

    将所得系列染色后的二维图像按顺序逐幅输入计算机后，采用作者研发的用于三维神经可视化的3D Nerve软件系统进行三维重建，获得正中神经干全长及内部各神经束的三维立体行径图谱。

    2  结  果

    2.1  正中神经连续断面观察

    正中神经在不同断面的神经束的数目以及位置变化均较大，各神经束均是混合束，未见有纯粹的感觉束或运动束的出现。

    2.1.1    起始部及上臂部  正中神经在内、外侧根组成处呈椭圆形，神经束数量为17个，其中以运动神经纤维为主的混合束为6个，其余11个是以感觉神经纤维为主的混合束(图1)。连续断面观察显示神经束数量逐渐减少，在大圆肌下缘有神经束8个，均为混合神经束。在肱骨中段部位神经束数量减少到6个，继续向下走行神经束数量又逐渐增加。

    2.1.2    肘部  正中神经在肘关节部呈扁带状，与正中神经下行穿过旋前圆肌两头之间，受到肌肉的挤压有关。由于  该处有骨间前神经及前臂浅组屈肌等分支加入，所以神经束数量有所增加。在肱骨内、外髁连线处神经束数量为14个，其中以运动神经纤维为主的混合神经束为9个，其余5个是以感觉神经纤维为主的混合神经束(图2)。

    2.１.3  前臂部及腕部

    正中神经在前臂接近圆形，神经束组成数量不等的神经功能束组。连续的神经断面观察显示正中神经在前臂神经束与束之间的神经纤维交错较少，并且运动神经纤维有所增加。正中神经在腕部呈扁平状，在桡骨茎突部位神经束的数量为21个，桡侧有1个以运动神经纤维为主的混合束，其余20个均为混合束(图3)，为神经束数量最多的部位。与正中神经在腕部发出大量终末支分布于拇收肌以外的鱼际肌、第l、2蚓状肌以及掌心、鱼际、桡侧3个半指的掌面及其中节和远节手指背面的皮肤相符合。

    2.2   三维显示

    在正中神经三维可视化过程中，利用3D Nerve采用不同的颜色来标识区分不同的神经束，束的粗细按内部各神经束的实际粗细进行适当缩小，这样可以看清正中神经内部的各神经束三维行径(图4)。为了更清晰地观测正中神经内部各神经束的三维立体行径，将正中神经全长等距离地分成九段进行三维显示  (图5)。

    正中神经可视化结果能够真实地再现正中神经干全长及其内部各神经束和束组的三维立体结构；形象地展示各神经束的交叉穿插、混合重组的变化；既能单独显示正中神经干或单个神经束的立体行径，又能将二者叠加混合显示，还能隐藏其它的结构，追踪单个神经束或整个正中神经干，从而动态地展示正中神经内部神经束的复杂结构(图6)。通过3D Nerve，重建的正中神经能在空间位置上绕任意轴旋转任意角度，或者以不同的速度连续旋转，便于从不同的角度对各神经束的形态、空间位置及相互毗邻关系进行观察；还可在任意断面进行任意角度的切割，并可在放大的视野下观察正中神经的显微结构(图1～7)。图1  正中神经内、外侧根汇合部神经断面示意图  共有神经束17个，其中6个神经束是以运动神经纤维为主的混合束，其余11个神经束是以感觉神经纤维为主的混合束  图2  正中神经在肘部肱骨内、外髁连线处神经断面示意图  共有神经束14个，其中9个神经束是以运动神经纤维为主的混合束，其余5个神经束是以感觉神经纤维为主的混合束  图3  正中神经在桡骨茎突部神经断面示意图  共有神经束21个，桡侧有1个以运动神经纤维为主的混合束，余20个均为混合束。图1～3中A为该神经断面的扫描图片进行轮廓分割的示意图(分辨率为2400 dpi),B为在3D Nerve中该神经断面的轮廓匹配示意图。淡蓝色代表以感觉神经纤维为主的混合束;绿色代表以运动神经纤维为主的混合束；紫蓝色代表混合神经束  图4  正中神经起始部位，长5 cm。A为神经束中心线示意图，每一中心线代表一神经束的走行行径；B为神经束表面重建示意图。正中神经内部神经束结构相当复杂，它们相互间不断交叉重组，形成独特的神经束结构。采用不同的颜色来标识区分不同的神经束，束的粗细按内部各神经束的实际粗细进行适当缩小，这样可以看清正中神经内部的各神经束三维行径。C为包括神经外膜的表面重建示意图。箭头所指方向为近端至远端的走行方向  图5  A～I分别等距离显示正中神经内部神经束的三维立体行径(自正中神经内外侧根汇合处至桡骨茎突)箭头所指方向为近端至远端的走行方向。采用不同的颜色来标识区分不同的神经束   图6  A～C示在3D Nerve中进行从近端至远端的正中神经追踪的连续截图  箭头所指方向为近端至远端的走行方向  图7  A、B图示从不同角度观察图6中E段正中神经的示意图  便于从不同的角度对各神经束的形态、空间位置及相互毗邻关系进行观察。C图示对E段正中神经行任意断面切割的示意图，可以观测该断面正中神经内各神经束的数量及分布位置。箭头所指方向为近端至远端的走行方向

    3  讨  论

    3.1  正中神经三维重建与可视化的意义

    周围神经缺损的修复与重建是当前周围神经外科领域的一大难题。目前临床上应用骨骼缩短、神经改道、自体神经移植或移位等方法来进行神经缺损的修复。神经移植虽然效果尚可，但是神经来源有限，且遗留有供区感觉减退，移植神经直径往往与受体神经不符等问题［7］。而组织工程化人工神经则有着明显的优点：(1)不受来源限制，可被制成任意长度和口径;(2)采用套接法将神经远近端放置于神经管内，手术简单，能有效避免吻合端神经瘤产生，并防止新生神经纤维向外生长，保护再生神经纤维有效地向远端延伸［8］。因此，近年来人们开始用组织工程方法体外构建人工神经，即将体外培养扩增的大量的雪旺细胞和生物材料复合来引导周围神经再生［9，10］。但是人工神经研制的重要前提条件是首先要明确神经的内部神经束的复杂交叉重组关系。只有按照人体神经内部天然精确结构来构建人工神经，才能获得最佳的效果。本研究利用机真实地实现了正中神经的三维可视化，能准确地显示正中神经内部每一神经束的各个断面及其全长的解剖结构及其相互关系，各神经束中任意断面的感觉与运动神经纤维的准确定位资料，因此对于组织工程化人工神经的仿生构建有着重要的指导意义。同时为临床上正中神经损伤的修复方式的选择提供一定的解剖意义。并且提供了一种周围神经系统内部显微结构三维可视化的有效方法，为虚拟人周围神经系统的构建作了有益的探索。

    3.2    定位方法

    三维重建要准确显示重建结构的空间形态，必须使连续切片的图像有和原物体一样的对应空间立体关系，即对图像进行定位。  若定位不准确，重建的图像就会失真。组织的连续冰冻切片在切片、染片的过程中不可避免地会产生一定的偏差，其位置的客观性和准确性均受到一定的限制，所以需要通过设置参照的方法来保证切片的对位始终准确［11］。定位方法一般可分为外定位和内定位2种，这2种方法各有优缺点。所谓外定位方法，是指采用各种机械的方法在连续切片图像上标记一些基准点，通过基准点的对齐来达到定位效果。陈增淦［12］等采用人长发作为外定位的材料，取得较好效果。而所谓内定位方法，是指根据生物组织的连续性和完整性，通过一定的配准算法达到两幅连续切片图像间的对齐。它具有灵活、准确度高和可进行回溯性研究等优点，所以是较有前途的一类定位方法。但是内定位并不足以解决一些非线性变形如切片的卷曲等情况，而且由于存在需要针对重建对象专门设计软件、人机交互工作量及计算量均较大等问题，还有待改进，目前还无法完全替代外定位的方法。因此采用内定位和外定位相结合的方法，定位精度将更为理想，这是今后的发展方向［13］。   

    本研究将标本固定在自行设计的支架上，采用4根人长发作为定位线，分别等距离固定在神经四周，头发切割后在切片上留下的点作为标志点。头发直径小，而且与玻片的粘附性较好，同时在玻片上用Poly?L?Lysine涂层，增加了组织的粘附能力，这样就保证了定位的准确性。作者认为这是计算机三维重建研究中一种准确而且实用的定位方法。

    3.3  图像的变形

    图像的变形也是图像信息处理时经常会遇到的一个难题。正中神经的标本长约47 cm，而冰冻切片机最多允许的标本长度为2～3 cm，所以必须将标本分割成多个长3 cm左右的组织块分别进行冰冻切片，将组织块固定在冰冻切片机上时可能产生位置偏移，导致切片角度的细微差别。连续组织切片可能会产生皱褶、破损或不规则畸变。此外，在染色和扫描过程中也有可能会产生图像的变形、旋转和偏移。这些变形均可以通过四个定位点的位置用软件进行还原，因为切片厚度仅为20 μm，可以认为这20 μm间距内的图像信息几乎是不变的，然后可以上一幅图像为模板，对相应位置图像信息进行校正，这样可以获得准确的原始图像信息。

    3.4  三维重建的方法

    三维重建的方法主要分为2类，一类是基于中间几何图元的表面绘制法，另一类是直接基于三维数据场的体素绘制法［14］。

    在本研究中，作者采用单轮廓线和多轮廓线之间的表面绘制法来进行重建，定义了三维神经表面的几何信息，获得了较好的外观效果。同时，由于作者在正中神经的轮廓分割及匹配时采用了部分手工干预，从而有效地提高了准确性。

    本研究首次应用3D Nerve较为成功地重建了正中神经的三维结构及其内部神经束的立体行径，为临床上正中神经损伤修复方式的选择和组织工程化人工神经的仿生构建提供了有益帮助。同时还确定了一种应用周围神经连续冰冻组织切片通过计算机辅助三维重建的实用方法，为数字化虚拟人神经系统的构建做出了有益的探索，所得的结果可以组合到中国数字化虚拟人数据库中，丰富我国数字化虚拟人的研究，有较为广泛的应用前景。

【参考】
  ［1］ 张晨阳，刘郑生，唐金树，等．用电刺激束支定位法修复远端尺神经和正中神经损伤［J］.中国矫形外科杂志，2000，9：900-901．

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［4］ Terzis JK，Brsdford L．A computerized study of the intraneural organization of the median nerve［J］．J Hand Surg(Am)，1984，9：605．

［5］ Watchmaker GP，Gumucio AC，Crandall ER，et al．Fasciculus topography of the median nerve:a computer based study to identify branching patterns［J］．J Hand Surg，1991，1：53-59．

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［13］李 华．数字化虚拟人［J］．，2001，5：20-23．

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