重症脓毒症患者血小板膜糖蛋白CD62p和CD63变化的临床意义
【摘要】 目的 观察重症脓毒症患者血小板膜糖蛋白CD62p、CD63表达水平的变化，探讨两者与重症脓毒症严重程度及预后的关系。方法 用荧光素标志的单克隆抗体和流式细胞仪检测40例重症脓毒症患者发病后不同时间血小板糖蛋白CD62p、CD63的分子表达，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定发病后24 h内血清前降钙素(PCT)和C反应蛋白(CRP)浓度, 并且进行相关性分析。结果 重症脓毒症患者发病后各时间点CD62p、CD63水平较正常对照均显著升高(P均<0.01);死亡组患者各时间点CD62p、CD63水平较存活组均升高(P 均<0.05)。CD62p、CD63水平与PCT、CRP呈正相关。结论 重症脓毒症患者血小板处于高激活状态, CD62p、CD63水平均显著升高，可以作为判断疾病严重程度及预后的指标。
【关键词】 脓毒症 血小板膜糖蛋白CD62p CD63 血清前降钙素 C反应蛋白
【Abstract】 Objective To investigate the changes of the platelet glycoprotein CD62p、CD63 in severe sepsis patients，and their relationship with severity and prognosis of patients. Methods CD62p、CD63 expressions were measured by flow cytometry（FCM）and platelet monoclonal antibodies at different periods after the onset of severe sepsis in 40 patients，Serum concentrations of procalcitonin(PCT) and C-Reactive Protein (CRP) were determined within 24 hours of the onset of severe sepsis. The relationship between all the determinations and the clinical picture and prognosis of the patients was analyzed. Result The expressions of the platelet glycoprotein CD62p、CD63 levels in severe sepsis group was significantly higher than normal group（P<0.01）. CD62p、CD63 levels were higher in non-survivors (P<0.05). There was significant positive correlation between the platelet glycoprotein CD62p、CD63 levels and PCT and CRP. Conclusion Platelets were significantly activated in septic patients，and the degree of platelet activation was correlated with the severity of sepsis and used a prognostic marker.
【Key words】 sepsis Platelet membrane glycoproteins CD62p CD63 PCT CRP
重症脓毒症至今仍是造成危重患者发生器官功能障碍甚至死亡的重要原因。目前研究表明：脓毒症早期血小板明显激活[1]。而血小板CD62p 和CD63 为静止血小板α颗粒膜和溶酶体膜的组成成分，其血浆浓度的改变成为血小板活化释放的特异性标志。本研究动态观察40例重症脓毒症患者血小板CD62p和CD63分子水平变化，来探讨重症脓毒症患者血小板的功能变化及其对预后的意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象及分组
选择2006年5月-2007年12月，温州医学院附二院ICU收治的40例重症脓毒症患者，其诊断根据美国胸科医师学会∕危重病医学会﹙ACCP∕SCCM﹚于2001年华盛顿国际脓毒症定义会议提出的诊断标准[2]。其中男24例，女16例；年龄19-68岁，平均年龄（42.7±11.8）岁（正态分布用 表示，偏态分布用中位数表示）；患者的APACHEⅡ评分12～36分，平均（18.7±5.8）分，记录患者的28d后的转归(死亡或存活)。排除标准：①发病前原有血栓性疾病者及其他引起血小板变化的疾病；②10 d内使用过抗血小板凝集药物，3d内有肝素抗凝史者。
选择同期健康体检者作为正常对照组：40例，其中男24例，女16例，年龄26～65岁，平均年龄（43.8±9.8）岁。两组的性别和年龄构成比较差异均无统计学意义，具有可比性。
1.2 主要试剂及仪器
荧光素标记的血小板单克隆抗体（简称单抗）：CD61-FITC为异硫氰荧光素标记的活化CD61单抗，CD62P-PE为藻红蛋白标记的抗CD62P单抗，CD63-PE为藻红蛋白标记的抗CD63单抗，均购自美国BD公司。FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司），激光光源为15 mW的氩离子激光。
1.3 方法
1.3.1 标本采集 所有患者于发病（指达到重症脓毒症诊断标准）后24 h内、3、5、7d用负压采血针抽取股静脉血约4mL，30min内完成血小板染色步骤。对照组用以上同样的方法进行血液标本采集。
1.3.2 CD62p CD63检测：在实验管内加入CD61 Per-CP和CD62-PE（藻红蛋白）、CD63-PE（藻红蛋白）各20 μL；在对照管内加入CD61 Per-CP、鼠抗人IgM-FITC（异硫氢酸荧光素）、鼠抗人IgG1-PE各20 μL；在对照管和实验管内加入未激活的血标本各5 μL；轻轻摇匀后，在室温暗处孵育20 min；各管加入1 mL 1%多聚甲醛PBS固定20 min；半小时内上机分析；以CD61-PerCP及侧向角光散射双参数设血小板门，取血小板细胞群，计数CD61、CD62P、CD63阳性细胞百分比。同时观察患者的意识、体温、呼吸、脉搏等生命体征及血常规、血生化、血气分析等指标。并在发病后24h内采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清PCT和CRP。对照组用以上同样的方法进行CD62p、CD63、PCT 和CRP水平检测。
1.4 统计学处理
采用SPSS11.5统计软件包。所有数据均进行正态性检验，正态分布的计量资料以 表示，两组均数比较采用t 检验。非正态分布的计量资料以中位数（P25,P75）表示，采用非参数检验的独立样本检验。相关分析用Person相关分析。P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重症脓毒症组血小板CD62p、CD63表达水平变化
实验组发病24h内血小板CD62p、CD63表达即升高,各时间点血清水平均较正常对照组显著升高(P 均<0.01)。
2.2 不同预后重症脓毒症患者CD62p、CD63表达水平比较
死亡组血小板CD62p、CD63表达水平较较存活组均升高（P均<0.05）。
2.3 重症脓毒症患者血清PCT 和CRP含量变化 实验组血清PCT 含量为(13.36±8.19) ug/L, 较正常对照值(0.16±0.31 )ug/L 明显升高(P < 0.01) ; 血清CRP含量为(57.09±33.60) ug/L, 较正常对照值(3.80 ±0.65mg/L ) 亦明显升高(P < 0.01)。
3 讨论
脓毒性休克的患者血液流变学和血小板功能均发生异常，随着病情加重血小板功能障碍加剧，血小板功能障碍在MODS发病机制中起更加重要的作用[3]。
CD62p是目前所知最能反映血小板活化的最特异性标志物，如果被凝血酶活化，血小板内的α颗粒质膜迅速融合，并介导血小板在内皮细胞上的滚动、黏附以及血小板与单核细胞间的作用[4]。Russwurm等[5]研究发现，脓毒症患者外周血中血小板CD62p表达增加，而且脓毒症的严重程度与CD62p表达呈正相关，与血小板-中性粒细胞间的黏附能力呈负相关，本研究结果显示，生理情况下血中存在少量的CD62p，但重症脓毒症患者体内CD62p明显增加，说明重症脓毒症患者发病即出现血小板活化，同时发现随着病情加重而升高，另外死亡组显著高于存活组,说明CD62p 程度可以反映脓毒症的严重程度。
CD63为血小板内溶酶体颗粒膜蛋白，在静息状态下血小板表面仅有极少量表达，血小板活化时可随脱颗粒反应而大量表达在血小板表面，并介导中性粒细胞对活化内皮的黏附，因此也是检测血小板活化的理想指标[6]。本研究结果显示，重症脓毒症死亡组血小板CD63阳性表达率较生存组升高，且随病情加重而升高，表明血小板活化是脓毒症的重要病理基础之一，提示常规检测血小板CD63阳性表达率可以作为预测脓毒症病情进展。
PCT 是无激素活性的降钙素前肽物质, 在脓毒症和感染的患者血浆中被发现明显升高, 其升高程度反映脓毒症的严重程度及预后[7]。CRP在各种感染和创伤时,血清CRP水平可升高,且与感染程度呈正相关。动态观测CRP的变化有利于检测疗效和判断预后[8]。2001 年国际脓毒症会议的脓毒症诊断标准已把PCT和CRP作为诊断指标之一[2]。本次研究进行了CD62p、CD63表达水平与PCT、CRP 相关分析，结果显示CD62p、CD63水平与PCT、CRP均呈正相关，故说明脓毒症患者血小板CD62p、CD63水平可以反映脓毒症患者的病情变化，且具有良好的临床意义。
综上所述，本研究证实了重症脓毒症患者体内早期就已经存在血小板的异常活化，且其活化程度与病情的严重程度及预后成正相关，故为脓毒症的发病机制、及预后判断提供了依据。
参 考 文 献
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