VEGF、SP在门脉高压大鼠肠黏膜组织的表达

【摘要】  目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）、P物质（SP）在门静脉高压症大鼠肠黏膜中的表达。方法：25只雄性SD大鼠随机分为两组，其中对照组10只，实验组15只。门脉高压模型制备对照组仅暴露并游离门静脉主干及左肾上腺静脉。造模2 w后分别检测两组的门静脉压力，采用免疫组织化学SABC法检测肠黏膜组织VEGF、P物质的表达情况。结果：术后2 w实验组大鼠腹壁血管、肠系膜血管扩张较对照组明显，实验组大鼠有1只可见腹腔内有少量腹水生成，余大鼠及对照组未见明显腹水生成。实验组大鼠门静脉压力较对照组明显升高（P<0.05）；免疫组化发现与对照组比较，实验组结肠部位VEGF、P物质的表达及小肠部位P物质的表达明显升高（P<0.05），差异有统计学意义；小肠部位VEGF的表达与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：门脉高压症肠黏膜病变（PHE）是多因素共同作用的结果，VEGF、SP可能参与了PHE的发生。

【关键词】  门脉高压；血管内皮生长因子；P物质；小肠；结肠

    Abstract    Objective:To explore the expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF） and substance P（SP） in intestinal mucosa tissue of rats with portal hypertension.Methods：25 male SD rats were divided into experimental group and control group randomly.In experimental group，the stem of portal vein and left adrenal vein of rats were ligated.2 weeks later，portal venous pressure of rats in 2 groups was measured，the expressions of VEGF and SP in intestinal and colon mucosa and colon tissue were detected by immunohistochemical SABC method.Results：Portal venous pressure of experimental group rats was significantly higher than that of control group rats（P＜0.05）.The expressions of VEGF，SP in colon mucosa tissue and the expression of SP in small intestinal mucosa tissue of experimental group rats were significantly increased than those of control group rats（P＜0.05）.Conclusion：Pathologic changes of intestinal mucosa tissue of rats with portal hypertension are consequence of multifactorial coaction.The changes of VEGF and SP expressions could play a role in intestinal mucosal lesion of rats with portal hypertension.

    Key words   portal hypertension，vascular endothelial growth factor，substance P，small intestine，colon      门静脉高压症（portal hypertension，PHT）是由肝硬化引起的门静脉系统及体循环血流动力学变化所致，门脉高压症所致上消化道的病变除食管和胃底静脉曲张外，尚有非静脉曲张疾病，其中常见的有门脉高压性胃病（portal hypertensive gastropathy，PHG）。近年来有研究报道门脉高压时亦存在类似PHG的一些肠道病变（portal hypertensive enteropathy，PHE），局部体液因子的改变在PHE病因学中的作用渐受关注 ［1］。本实验旨研究肝前型门脉高压模型大鼠肠黏膜病变中血管内皮生长因子（VEGF）及P物质的变化及意义。

    1   材料与方法

    1.1   实验材料

    1.1.1   实验动物   雄性SD大鼠25只，体重250 g～300 g，购于河北医科大学实验动物中心。

    1.1.2   实验试剂   兔抗大鼠VEGF单克隆抗体、通用型过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒、生物素标记兔抗山羊IgG染色试剂盒及DAB均购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗大鼠SP多克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司。

    1.1.3   实验仪器   压力传感器（型号为TSD104A ）；MP2100 型多道生理记录仪（美国BIOPAC公司制造）；MIAS-2000型医学图像彩色分析系统（山西医科大学医学实验中心提供）。

    1.2   实验方法

    25只雄性SD大鼠随机分为两组，其中对照组10只，实验组15只。门脉高压模型参照尹朝晖等 ［2］的方法制作。具体方法：实验前12 h禁食，8 h禁水。予3%戊巴比妥钠溶液每100 g体重0.1 mL腹腔内注射麻醉，开腹后暴露并游离门静脉主干，沿其纵轴外置一19 号钝性针头，于近肝门处用3号～0号丝线结扎门静脉主干及外置针头后拔针；再将结扎线两端分别从门静脉后绕过，结扎线两端穿针引出体外固定于皮下，之后暴露游离左肾上腺静脉并结扎；术后7 d收紧皮下缝线，完全阻断门静脉血流。对照组仅暴露并游离门静脉主干及左肾上腺静脉。

    1.3   检测项目与方法

    1.3.1   门静脉压力（portal vein pressure，PVP）测定   门静脉完全结扎后2 w，将两组大鼠麻醉后开腹，找到肠系膜上静脉，用20号套管针穿刺肠系膜上静脉近端，退出针芯并将套管送至门静脉结扎远端，将该处所测得的压力代表门静脉压力。对照组因无粘连可直接穿刺门静脉测压，套管针另一端接压力传感器，传感器将采集到的压力信号转换成数字信号后输入机，采用MP2100型多道生理记录仪测定门静脉压力，单位用mmHg表示。

    1.3.2   小肠与结肠组织学观察   采用肠组织VEGF及SP免疫组化染色及半定量分析。门静脉完全结扎后2 w处死大鼠，剪取小段空肠（距空肠悬韧带5 cm）、乙状结肠组织，经10%甲醛溶液固定24 h后，脱水作石蜡包埋、切片（约4 μm），采用免疫组织化学SABC法检测空肠、乙状结肠组织中VEGF及SP表达情况，应用MIAS-2000型医学图像彩色分析系统（山西医科大学医学实验中心提供）测定肠组织VEGF及SP平均面密度值。每张切片随机选取5个视野， 然后取其均值，转化为阳性单位。

    1.4   统计学方法

    应用SPSS12.0统计软件分析，检测数据以均数±标准差（x±s）表示，计量资料组间比较采用t检验。

    2   结   果

    术后2 w实验组大鼠腹壁血管、肠系膜血管扩张较对照组明显，实验组大鼠有1只可见腹腔内有少量腹水生成，余大鼠及对照组未见明显腹水生成。实验组大鼠门静脉压力较对照组明显升高（P<0.05）。VEGF表达情况：阳性细胞可见黄染颗粒，主要见于黏膜和黏膜下层血管内皮，在黏膜和黏膜下层间质也可见黄染颗粒。小肠部位VEGF表达实验组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），而结肠部位VEGF表达实验组明显高于对照组（P<0.05）。SP表达情况：黏膜层可见SP阳性黄染产物，于黏膜下层和肌间尚可见少量黄染SP神经纤维，小肠及结肠SP表达强度实验组明显高于对照组（P<0.05）。结果见表1。

    3   讨   论

    门脉高压症肠黏膜病变机理至今尚不清楚，但在外科门腔分流术和经颈静脉肝内门体分流术解除门脉高压后， 肠黏膜高灌注得到明显改善，并能控制PHE弥漫性肠黏膜出血，说明门静脉压力与PHE有相关性［3］。随着对门静脉高压症肠黏膜病变认识的加深，血管活性因子等体液因子在PHE中的作用日渐受到关注，初步研究提示局部体液因子参与PHE的进程。

    VEGF是1989年Tischer E等 ［4］在牛垂体星状细胞体外培养分离出的一种糖蛋白，其在体内外都表现出特异性促进血管内皮细胞生长并诱导血管生成的作用，故此称为VEGF。VEGF是最有力的血管生成因子，它通过和血管内皮细胞的特异性受体结合，既可促进新生血管形成，加快受损组织修复，也可增加血管通透性，使间质水肿，加重局部病变。本研究中免疫组化结果显示，VEGF在实验组大鼠小肠黏膜血管中表达与对照组无明显差别，在结肠部位实验组明显高于对照组。可能是在门脉高压症小肠黏膜病变中VEGF无特殊意义，或者VEGF在门脉高压症小肠黏膜病变中表达有阶段性。VEGF在实验组大鼠结肠黏膜血管中高表达提示结肠黏膜存在缺氧， 同时缺氧可致黏膜细胞有氧代谢发生障碍， 三磷酸腺苷含量下降， 导致黏膜脆性增加及对损害因子的敏感性增高， 黏膜屏障受损， PHE发生 ［5］。

    P物质是一种发现最早，广泛分布于外周和中枢神经系统中具有众多生物活性的11肽。SP几乎存在于全身， 可由神经细胞和肠胃内分泌细胞产生和分泌，具有扩张血管，降低血压及收缩胃肠道平滑肌促进其运动的作用。SP介导血管扩张的机制尚未完全清楚，有研究提示P物质可能通过与血管内皮细胞NK1受体相结合而产生NO，NO通过增高cGMD水平，降低血管平滑肌张力，调节内皮细胞，从而发挥舒张血管的作用 ［6］。本研究中实验组SP表达强度较对照组增强，其升高一方面可使肠黏膜局部血管扩张，加重淤血，并可影响全身循环系统；另一方面，SP可使胃肠道运动增强，促使血液回流，减轻肠黏膜的淤血。因此，SP在门脉高压症肠黏膜病变中的作用是复杂的、多方面的。

    综上所述，肠黏膜屏障受损可能与（下转第50页）（上接第39页）继发的肠黏膜缺血缺氧改变、缺血再灌注损伤和炎症介质等因素有关［7］。门脉高压症肠黏膜病变是多因素共同作用的结果，VEGF、SP可能参与了PHE的发生发展，其机制尚有待进一步的阐明。

【】
  ［1］Ohta M，Kaviani A，Tarnaw ski A S，et al.Portal hypertension triggers local activation of inducible nitric oxide synthase gene in colonic mucosa［J］.Gastrointest Surg，1997，1（3）：229-235.

［2］尹朝晖，刘浔阳，卢焕元，等.大鼠食管静脉曲张模型的建立［J］.中华实验外科杂志，2003（8）：16-19.

［3］Kozarek R A，Botoman V A，Bredfeldt J E，et al.Portal colopathy：prospective study of colonoscopy in patients with portal hypertension.［J］.Gastroenterology，1991，101（5）：1 192-1 197.

［4］Tischer E，Mitchell R，Hartman T，et al.The human gene for vascular endothelial growth factor：Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing［J］.J Biol Chem，1991，266（18）：11 947-11 954.

［5］赵永忠，王波，王天才，等.血管内皮生长因子在大鼠门脉高压性胃病发病机制中的作用［J］.华中科技大学学报：医学版，2003，32（2）：163.

［6］Hall J M，Brain S D.Interaction of amylin with calcitonin gene-related peptide receptors in the microvasculature of the hamster cheek pouch in vivo［J］.Br J Pharmacol，1999，26（1）：280-284.

［7］Andersson R，Wang X D.Gut barrier dysfunction in experimental acute pancreatitis［J］.Ann Acad Med Singapore，1999，28（1）：141-146.