内异康复栓对大鼠异位子宫内膜细胞凋亡基因Bcl-2/Bax的影响

【摘要】  目的 探讨内异康复栓对大鼠异位子宫内膜细胞相关凋亡基因Bcl?2/Bax蛋白的影响。方法 建立大鼠子宫内膜异位症模型，取各组异位子宫内膜组织固定、切片，采用免疫组化法检测凋亡相关基因Bcl?2/Bax蛋白表达和相互关系。结果 内异康复栓与模型组相比，Bcl?2蛋白的表达明显下降(P<0.01)，Bax蛋白的表达明显增加(P<0.01)。结论 内异康复栓子宫内膜异位症可能是通过Bcl?2/Bax途径诱导异位子宫内膜细胞凋亡，应用于临床效果显著。

【关键词】  内异康复栓;子宫内膜异位症;大鼠;细胞凋亡

　　ABSTRACT：Objective To investigate the effect of Neiyikangfu Suppository on expression of Bcl?2/ Bax in ectopic endometrium of rats.Methods The model of endometriosis was established in rats and the ectopic endometrial tissue in every group was collected, fixed and sliced. The expression of Bcl?2 and Bax in ectopic endometrium was detected by immunohistochemical staining with specific monoclonal antibodies.Results Compared with model group, the expression of Bcl?2 protein was obviously deceased (P<0.01) and the expression of Bax protein was significantly increased in Neiyikangfu Suppository group (P<0.01).Conclusion Neiyikangfu Suppository has the therapeutic effect on endometriosis by regulating the expression of apoptosis?revelant gene Bax/Bcl?2.

　　KEY WORDS：Neiyikangfu Suppository;Endometriosis;Rat;Apoptosis

　　子宫内膜细胞自发性凋亡是内膜组织保持正常结构和功能的关键因素, 而凋亡异常可促进子宫内膜异位症(EMT)的发生和[1, 2]。目前认为bcl?2/Bax为相关调节基因，bax主要诱导凋亡，bcl?2则抑制凋亡，本实验建立大鼠子宫内膜异位症动物模型，从基因水平探讨内异康复栓治疗子宫内膜异位症的作用机理。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　健康雌性SD大鼠40只，体质量200±50g，武汉大学医学院实验动物中心提供，医动字第19—084号。

　　1.2 主要药品和试剂

　　内异康复栓浸膏:由大血藤(Coulissargentodoxae)、丹参、三棱、土鳖虫等组成,成都中医药大学附属制剂室提供(批号: 050928);丹那唑胶囊0.1g/粒(上海华联制药有限公司012042)， Bax 和Bcl?2蛋白免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司产品)。

　　1.3 主要仪器

　　轮转式石蜡切片机(浙江金华益迪医疗设备厂)，光学显微镜照相系统(日本Olympus公司)，H?600型透射显微镜产品(日本Olympus公司)。

　　1.4 分组及给药

　　采用自体移植法[3]建立EMT大鼠模型, 30h后随机抽动物剖腹证实模型成功后,随机分为内异康复栓剂量组(3.0 g· kg-1·d-1) ,丹那唑组(0.2 g· kg-1·d-1) , 模型组和假手术组，每组10只。内异康复栓浸膏剂量组直肠给药,丹那唑组灌胃给药,模型组和假手术组灌肠与内异康复栓组等容积的生理盐水。直肠给药前轻轻按摩并挤压大鼠肛门周围,促使直肠内积存的粪便排出,然后将直肠给药针头轻轻插入大鼠直肠约4.5 cm,将药液缓缓推入,同时观察实验动物的状态,给药后观察30 min,若有药液排出,即予补量。造模后30d开始给药,持续给药30d。

　　1.5 标本的采集与处理

　　于末次给药后，麻醉大鼠,立即剖腹肉眼观察异位子宫内膜形态，取异位病灶内膜组织和在位子宫送检。依据造模后病理组织形态学检查抽样结果,选取左侧子宫中段旁肠系膜异位内膜病灶及同侧子宫中段作为标本送检。

　　1.6 异位子宫内膜组织切片及电镜样品制备[4]

　　分别取异位子宫内膜组织及假手术组正常子宫内膜组织。生理盐水冲洗后,光镜取材,常规制备组织切片及电镜样品。

　　1.7 检测指标与方法

　　采用链酶亲和素2生物素2酶复合物( SABC)免疫组化检测,按试剂盒说明书操作,Bcl?2和Bax蛋白阳性表达指数(positive expression index, PEI)，PEI=平均光密度×阳性细胞百分比×100。

　　1.8 统计学分析

　　数据均以±s表示， 用方差分析并作Group t检验， 以P<0.05为差异有显著性意义。

　　2 结 果

　　2.1 透射电镜下观察大鼠异位子宫内膜上皮细胞的变化及凋亡细胞的形态

　　模型组异位子宫内膜细胞的上皮细胞表面有较发达的微绒毛和丰富的丝状附着物，胞浆中有丰富的细胞器，线粒体、溶酶体、内质网、核糖体均正常，细胞间有典型的邻接结构，与正常内膜上皮细胞相似(图1)。丹那唑组和内异康复栓组中分别可见异位子宫内膜细胞的上皮细胞表面微绒毛明显减少或缺失，胞浆中溶酶体增多，粗面内质网不同程度的扩张，线粒体肿胀呈空泡状，嵴消失，并可见凋亡小体(图2)。

　　2.2 内异康复栓对异位子宫内膜细胞凋亡的Bcl?2蛋白表达的影响

　　在模型组，Bcl?2蛋白的表达(1.13±0.05)明显高于假手术组(0.67±0.08)，两者比较差异有显著性意义(P﹤0.05)。内异康复栓组与模型组相比，Bcl?2蛋白的表达明显下降(0.52±0.04)，差异也有显著性意义(P﹤0.05)，但与丹那唑组(0.49±0.01)比较，无明显差异。

　　2.3 内异康复栓对大鼠异位子宫内膜Bax蛋白表达影响

　　在模型组，Bax蛋白的表达(0.85±0.11)明显低于假手术组(0.17±0.13)，差异有显著性意义(P﹤0.05)。内异康复栓组(1.78±0.12)与模型组相比，Bax蛋白的表达增加明显(P﹤0.05)，但与丹那唑组(1.67±0.13)比较无明显差异。

　　3 讨 论

　　EMT发病机理尚不完全清楚,目前多认为,本病可能是一种在免疫及细胞凋亡异常基础上发生经血逆流而导致的综合结果[5, 6],临床上尚无有效的根治措施。凋亡是子宫内膜细胞保持周期性结构和功能稳定的关键因素,异位内膜细胞得以在宫腔外种植并继续存活,与其对凋亡的抵抗力增强有关。目前认为Bcl?2/Bax互为相关调节基因，Bax主要诱导凋亡，而bcl?2则抑制凋亡。若通过药物诱导异位子宫内膜细胞凋亡，使病灶消退，则可达到治愈目的。因此，研究细胞凋亡对探讨子宫内膜异位症的发病机理及指导临床有重要意义。

　　EMT属于中医“痛经”、“癥瘕”、“不孕症”等病证范畴。瘀血内阻是产生EMT症状和体征的关键,湿热瘀结也是EMT的主要病机之一,是病情缠绵难愈,反复发作的病理基础。内异康复栓以“湿热瘀结”立论,处方由大血藤、丹参、三棱、土鳖虫等组成,功效清湿化瘀、行气止痛、消癥散结。由于EMT的病变主要在盆腔局部,栓剂直肠给药可获得理想的治疗效果。

　　本实验结果显示，模型组中Bcl?2蛋白的表达较假手术组增强，而Bax蛋白的表达则明显低于假手术组。给予内异康复栓治疗后，Bcl?2蛋白明显减少，Bax蛋白表达明显升高。电镜下观察其异位子宫内膜上皮细胞 ，亦为明显细胞凋亡的形态特征。表明内异康复栓可通过调节Bax/ Bcl?2蛋白比例，从而诱导异位子宫内膜细胞的凋亡起到治疗的作用，从基因水平初步阐明了内异康复栓的作用机理，为临床治疗子宫内膜异位症提供有力的理论依据。

【】
  　　[1]Harada T,Kaponis A,Iwabe T,et al.Apoptosis in human endometrium and endometriosis[J].Hum Rep rod Update，2004，10(1)∶29

　　[2]NishidaM,Nasu K,Ueda T,et al.Endometriotic cells are resistant to interferogamma induced cell growth inhibition and apoptosis: a possible mechanism involved in the pathogenesis of endometriosis[J].Mol Hum Rep rod，2005， 11(1)∶29

　　[3]杨耀芳，王钦茂，方学明，等.建立大鼠子宫内膜异位症模型的评价方法[J].药通报, 1998，14(5)：469

　　[4]杨景山.医用细胞化学和细胞生物技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,2000:63

　　[5]Hastings JM,Fazleabas AT.Future directions in endometriosis research[J].Semin Rep rod Med，2003， 21 (2)∶255

　　[6]Vinatier D,Orazg G,CossonM,et al.Theories of endometriosis[J].Eur J Obstet Gyencol Rep rod Biol，2001， 96(1)∶21