原发性高血压患者血浆ADMA浓度外周循环内皮祖细胞数量的变化
【摘要】 目的 探讨原发性高血压（EH）患者血浆非对称性二甲基精氨酸(ADMA)浓度、外周循环内皮祖细胞(EPCs)数量的变化及两者之间的关系。方法 选取停止服用降压药至少2周以上并排除冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病的原发性高血压患者46例，对照组25例为健康体检者。采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定血浆ADMA含量，流式细胞术分析外周循环EPCs。结果 EH组血浆ADMA浓度［(0.363±0.029)μg/ml］显著高于对照组［(0.319±0.022)μg/ml］(P<0.01)。EH组外周循环EPCs数量［(0.368±0.121)%］显著低于对照组［(0.588±0.139)%］（P<0.01）。血浆ADMA浓度与外周循环EPCs数量呈负相关关系(r=-0.706,P<0.01)。结论 EH患者血浆ADMA浓度升高，外周循环EPCs数量减少，两者之间呈负相关关系。EH患者循环EPCs数量下降部分原因可能是由于血浆ADMA水平升高所致。
【关键词】 原发性高血压 非对称性二甲基精氨酸 内皮祖细胞
【Abstract】 Objective To investigate the change of concentration of plasma asymmetric dimethylarginine(ADMA) and number of circulating endothelial progenitor cells（EPCs）in essential hypertensive patients(EH). Methods 46 EH patients and 25 healthy controls were recruited. Plasma ADMA were measured by reversed-phase high performance liquid chromatogram(RP-HPLC). Circulating EPCs was determinated by flow cytometry assay. Results The concentration of plasma ADMA in EH patients was higher than that in control ［(0.363±0.029)μg/ml vs (0.319±0.022)μg/ml, P<0.01］. The number of circulating EPCs in EH patients was lower than that in control ［(0.368±0.121)% vs(0.588±0.139)%, P<0.01］. The concentration of plasma ADMA was correlated inversely with the number of circulating EPCs in EH group(r=-0.706, P<0.01). Conclusions The plasma ADMA concentration is increased and the number of circulating EPCs is decreased in EH patients. The concentration of plasma ADMA is correlated inversely with the number of circulating EPCs. The number of circulating EPCs is partly decreased because of the elevation of the plasma ADMA concentration.
【Key words】 Essential hypertension Asymmetric dimethylarginine Endothelial progenitor cells
血管内皮功能损伤是原发性高血压(EH)始动机制之一。非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric Dimethylarginine, ADMA)是一个内源性一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂，它可能通过抑制NO的产生，影响血管内皮功能［１］。内皮祖细胞(EPCs)是一类能分化为血管内皮细胞的前体细胞，来源于骨髓，在一定状态下能够动员到外周循环，分化为成熟内皮细胞并参与血管修复或形成。冠心病患者血浆ADMA水平和外周循环EPCs存在的关系已有报道［2］，而原发性高血压患者血浆ADMA和外周循环EPCs之间的关系尚不清楚。本研究旨在探讨原发性高血压患者血浆ADMA浓度、外周循环EPCs数量的变化，以及两者之间的关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料 选取2008年4～8月本院心内科续贯住院或门诊EH患者46例。EH诊断标准高血压防治指南［3］。所有患者入组前未曾服用任何降压药或停止服用降压药至少>2周；所有入选对象排除标准：冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、继发性高血压病、肝肾功能异常、周围血管疾病、既往有脑卒中及心脏瓣膜病等重大疾病、未绝经女性以及入组前2周内曾服用他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂、阿司匹林、抗氧化剂等可能影响外周循环EPCs的药物。选取同期本院健康体检者25例为正常对照组。EH组46例，其中男27例，女19例；年龄35～82岁，平均（54.65±10.3）岁，体重指数（23.4±3.5）kg/m2，总胆固醇（TC）（4.88±1.0）mmol/L，甘油三脂（TG）（2.65±1.34）mmol/L，尿酸（UA）（320.6±108.0）mmol/L，血肌酐（56.1±12.5）mmol/L。对照组25例，其中男17例，女8例；年龄35～82岁，平均（53.08±12.69）岁，体重指数（22.8±2.6）kg/m2，TC（4.67±0.85）mmol/L，TG（3.06±1.21）mmol/L，UA（306±84.2）mmol/L，血肌酐（60.5±9.6）mmol/L。两组间性别、年龄、体重指数、TC、TG、UA、血肌酐的差异均无统计学意义（均P>0.05）。
1.2 方法 所有入选者均空腹，抽取肘静脉血3ml。吸取100μl供流式细胞术分析外周循环EPCs水平，剩余血标本进行离心，取上清血浆，-20℃保存，待同批HPLC分析测定血浆ADMA水平。每个标本均在采血后4h内完成。
血浆ADMA水平测定采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）。ADMA标准品、OPA、3－巯基丙酸均购自Sigma公司。取血浆置于室温冻融,应用5-磺基水杨酸沉淀,离心机离心(12000r/min)10min,取上清液100μl，加OPA衍生试剂进行柱前衍生，取20μl进样，读取数值,绘制标准曲线,出血浆ADMA数值。HPLC色谱条件:高效液相色谱仪：Agilent1100系列，色谱柱：Waters SymmetryC18柱（5μm，3.9mm×150mm），流动相:A0.05mmol/L乙酸钠（pH6.8）,B甲醇，线性梯度洗脱B%〔(14% 15min，31% 25min，45% 25min（V/V/V）)〕，流速1.0ml/min，荧光检测，激发波长330nm，发射波长450nm。
外周循环EPCs水平采用流式细胞术分析。取外周血100μl,加入FITC标记的CD34单克隆抗体(BD公司生产),加入PE标记的KDR(VEGFR-2)单克隆抗体(BD公司生产)对细胞进行标记,经孵育、洗涤后上机分析,同型对照为FITC标记和PE标记的小鼠IgG1(BD公司生产)。采用BD公司的FACS Calibur流式细胞仪以Cell Quest软件进行流式细胞分析。在前向角和侧向角散射光双参数点图上对淋巴细胞群设窗,共收集细胞7000个,CD34和KDR双阳性细胞(CD34+/KDR+)的百分率即为EPCs水平。
1.3 统计学处理 统计学分析采用统计软件SPSS13.0统计。计量资料以（x±s）表示，其中组间比较采用t检验，相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血浆ADMA浓度、外周循环EPCs数量分析（见表1） EH组血浆ADMA浓度显著高于对照组(P<0.05)。EH组外周循环EPCs数量显著低于对照组（P<0.01）。表1 EH组和对照组外周循环CD34+/KDR+细胞水平、ADMA水平比较
2.2 EH组血浆ADMA浓度与外周循环EPCs数量的相关性分析 采用Pearson相关分析，血浆ADMA浓度与外周循环EPCs数量呈负相关关系，相关系数为-0.706，P<0.01。
3 讨论
ADMA是内源性的NOS抑制剂，可以抑制eNOS的活性，减少NO的产生。而血管内皮功能损伤是原发性高血压(EH)始动机制之一。本研究EH组为单纯性高血压患者，与国内其他类似研究不同的是，本研究除了排除冠心病、糖尿病等以外，入组病例均停用降压药至少2周以上来排除降压药如ACEI、CCB类药物对ADMA、EPCs的影响。结果显示，与对照组相比，EH患者血浆ADMA显著升高（P<0.01），与Perticone, F［4］等研究结果一致。这提示EH患者血浆ADMA升高可能是其血管内皮细胞合成NO障碍的一个重要原因。Takiuchi等［5］研究发现：EH患者的冠状动脉和外周血管内皮功能的损伤与血浆ADMA的升高显著相关，并独立于胰岛素抵抗或左心室肥厚，血浆ADMA浓度的升高在高血压患者内皮功能不全中起到主要作用。
EPCs是一群能增殖分化为成熟血管内皮细胞，并参与出生后血管新生及内皮损伤修复的前体细胞。动物实验和临床研究均证实，新生血管中25%的内皮细胞是由EPCs分化而来的，血管修复部分依赖于循环血中的内皮祖细胞在损伤部位的粘附、聚集、增殖、分化形成新的血管内皮［6］。Werne等［2］进行了有507例冠心病患者参加的CD34+/KDR+细胞数量对心血管事件预测价值的研究，在伴有高血压的432例冠心病患者的亚组分析中发现高血压与CD34+/KDR+细胞数量之间呈负相关。本研究亦显示：与正常组对比，EH患者外周循环EPCs(CD34+/KDR+)显著减少（P<0.01）。
近来研究认为内皮型NOS(eNOS)来源的NO在EPCs的动员、分化及功能发挥过程中起了关键的作用［7，8］，而ADMA是内源性的NOS抑制剂，可以抑制eNOS的活性，减少NO的产生，故ADMA可能是对EPCs产生抑制作用。Thomas Thum［9］等人研究结果显示冠心病患者血浆ADMA水平和外周循环EPCs数量呈负相关。在体外培养中，随着ADMA浓度增加，EPCs形成菌落的数量和大小都相应的减少。本研究显示EH患者血浆ADMA浓度与外周循环EPCs数量呈负相关关系（相关系数r-0.706，P<0.01），因此可以认为EH患者循环EPCs数量下降和功能受损部分原因可能是由于血浆ADMA水平升高所致。
综上所述，本研究结果认为：EH患者血浆ADMA浓度升高，外周循环EPCs数量减少，两者之间呈负相关。EH患者循环EPCs数量下降和功能受损部分原因可能是由于血浆ADMA水平升高所致。
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1 刘俊,王洪巨.非对称性二甲基精氨酸生物学特性.岭南心血管病杂志,2007,13:302～304.
2 Werner N, Kosiol S, Schiegl T, et al. Circulating endothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes. N Engl J Med,2005,353(10):999～1007.
3 高血压防治指南修订委员会.中国高血压防治指南(2005年修订版).高血压杂志,2005,13增刊:2241.
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5 Takiuchi S, Fujii H, Kamide K, et al. Plasma asymmetric dimethylarginine and coronary and peripheral endothelial dysfunction in hypertensive patients. Am J Hypertens,2004,17:802～808.
6 Colleran P N, TannerM A, Latcham S L, et al. An acute exercise bout is associated with increases in endothelial progenitor cell number. FASEB Journal,2005,19(5):A1659.
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9 Thum, T, Tsikas, D,Stein, S,et al.Suppression of endothelial progenitor cells in human coronary artery disease by the endogenous nitric oxidesynthase inhibit-tor asymmetric dimethylarginine. J Am Coll Cardiol,2005,46:1693～1701.
