吡格列酮和罗格列酮对脂多糖诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

【摘要】  目的：观察胰岛素增敏剂——噻唑烷二酮类(TZD)药物吡格列酮和罗格列酮对脂多糖（LPS）诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)异常增殖的影响。方法：组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞；LPS（0.1，1，10 mg·L-1）干预血管平滑肌细胞不同时间（0，12，24，48，72h）后，分别用吡格列酮和罗格列酮与10 mg·L-1LPS共同孵育72h，四甲基偶氮咗盐微量酶比色（MTT）法检测血管平滑肌细胞增殖。结果：10mg·L-1LPS孵育72h导致血管平滑肌细胞增殖程度最明显（P<0.01）; 吡格列酮和罗格列酮可明显抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞增殖。结论：噻唑烷二酮类代表药吡格列酮和罗格列酮均对LPS诱导的血管平滑肌细胞异常增殖具有抑制作用，该类药物可能在心血管疾病方面有较好的应用前景。

【关键词】  脂多糖； 血管平滑肌细胞； 增殖； 吡格列酮； 罗格列酮

目前认为动脉粥样硬化（artherosclerosis;AS）是一种免疫调节的炎症性疾病, 细菌性感染是临床上常见的致病原因,其中以内毒素血症最为多见,其主要毒性成分是脂多糖（LPS）［1］。血流中的LPS可损伤内皮细胞、血小板,甚至经破损的血管壁直接作用于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs),导致其增殖和迁移，引起一系列心血管反应。而VSMCs的增殖与迁移是动脉粥样硬化发生、的重要环节，可加速动脉粥样硬化的进程。胰岛素增敏剂--噻唑烷二酮类(TZD)药物,是目前临床上治疗2型糖尿病的一类新的药物,其代表药为罗格列酮(rosiglitazone，Rosi)和吡格列酮(pioglitazone,PIO)。近年研究发现此类药在心血管保护、炎症形成的抑制中起关键作用［2］。本研究通过观察吡格列酮和罗格列酮对LPS诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)异常增殖的影响,探讨Pio和Rosi在治疗动脉粥样硬化中的可能作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料 

    1.1.1  动物  SD大鼠由潍坊医学院试验动物中心提供,体重100～150 g。

    1.1.2  试剂  DMEM培养基（美国Gibico公司）;LPS（Sigma ）;MTT(sangon);Pio(江苏恒瑞制药公司)；Rosi（革兰素史克）；胰蛋白酶（美国Gibico公司）；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；兔抗鼠α-actin抗体及sABC试剂盒均购自武汉博士德公司。

    1.2  方法

    1.2.1  大鼠胸主动脉VSMCs的培养与鉴定  用组织块贴壁法培养大鼠TASMCs。大鼠经戊巴比妥钠以45 m g/kg麻醉后,无菌条件下迅速取出胸主动脉,仔细剥去外膜, 沿纵向剪开血管，刮去内皮细胞,以无血清培养液洗2～3次,剪碎成1 mm×1 mm×1 mm,均匀种植于瓶底壁,加入含20%胎牛血清的DM EM培养液［3］, 在5％CO2、37℃孵箱中培养，静止4 d。观察后换液。细胞铺满瓶底80%以上时加入2.5 g/L胰蛋白酶消化,1∶2分装传代，使用含10％胎牛血清的培养基培养。本实验培养的细胞相差显微镜观察:细胞外观呈长梭形，细胞生长致密时排列成束，并可重叠生长，表现为典型的“波峰”与“浪谷”状。采用免疫组化法对VSMC(α-actin)进行鉴定: 激光共聚焦显微镜观察，证实为VSMCs。实验所用细胞为3～8代。

    1.2.2  实验分组  在进行干预前，无血清培养24h使细胞同步化，然后分组：①空白对照组：加入含有1%胎牛血清的DMEM培养液；②LPS  0.1，1，10mg·L-1组作用不同时间（12，24，48，72h）；③10mg·L-1 LPS与Pio（1，10，100umol·L-1）共同作用72h；④10mg·L-1 LPS与Rosi(1，10，100 umol·L-1）共同作用72h。

    1.2.3   MTT法测定细胞增殖  用0.25%胰蛋白酶消化细胞并用含10%胎牛血清的DMEM培养液调制成5×104个/ml，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中,每孔接种100μl,在37℃,5%CO2条件下培养至细胞生长成次融合状态时,无血清培养24 h后,加入各种干预因素继续培养,同时设调零组和正常对照组(未加任何刺激因素),每组设3个复孔,干预结束后每孔加入MTT(5 g/l)20μl培养4 h,弃去孔内液体,每孔加入DMSO 150μl,震荡10 min后,在自动酶标检测仪上读取波长为570 nm的光吸收值(A)。实验结果以A值表示,A值与活细胞的增殖呈正比,A值越大,表明细胞增殖越旺盛。每项试验重复3次。

    1.3  统计学处理

    数据用x±s表示,用SPSS13.0软件进行统计学处理,采用单因素方差分析两组的均数比较采用S-N-K方法进行，以 P<0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1   LPS对VSMCs增殖的影响

    0.1 mg·L-1、1 mg·L-1 和10 mg·L-1LPS作用12h及0.1 mg·L-1作用24、48h  对VSMCs增殖几乎无影响，其余各浓度的LPS作用24、48、72h均导致VSMCs增殖，与LPS浓度为0组相比差异有显著意义（P<0.05）。其中10mg·L-1LPS孵育72h明显诱导平滑肌细胞增殖，故做药物抑制作用时LPS浓度选择10mg·L-1。见表1。表1  不同浓度、时间LPS处理引起VSMCs的变化注：与空白对照组(0 mg/L 的LPS作用0 h组)相比, # P<0.05,* P<0.01。

    2.2  药物对LPS诱导VSMCs增殖的影响

    LPS10mg·L-1分别与吡格列酮、罗格列酮共同孵育72h，LPS促进VSMCs增殖作用被抑制，罗格列酮对VSMCs增殖的抑制作用略微大于吡格列酮并且呈时间剂量依赖性。与LPS 10mg·L-1相比，差异有显著意义（P<0.05）。见表2。表2  吡格列酮、罗格列酮对（LPS）诱导血管平滑肌细胞增殖的影响注： 经单因素方差分析，两两比较；与LPS10mg·L-1组比较，# P<0.05,* P<0.01。

    3  讨论 

    动脉粥样硬化的机制研究已经进行了一百多年,日渐被公认属于一种慢性炎症疾病。Ross［4］于1999年以新的论据在损伤反应学说的基础上,明确提出“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病”。引起血管壁炎症反应的因素很多, 细菌性感染是临床上常见的致病原因之一,其中以内毒素血症最为多见。近年来的研究表明，作为内毒素主要毒性成分的LPS参与了动脉粥样硬化病变的形成过程［5］。但其影响机制尚未完全明了，本研究发现LPS可促进大鼠VSMCs异常增殖。VSMCs是粥样斑块中最主要的成分。斑块中的VSMC处于合成状态，具有分裂和增殖能力，并可迁移，在内膜下增生。其收缩蛋白合成能力降低，细胞不能收缩，但能捕获和贮存大量胆固醇和脂质，且降解和清除能力降低;还能合成和分泌大量的细胞外基质，后者与细胞外脂肪截获后，成为脂纹状斑块。由于细胞增生，管腔变窄，血管壁脂质的堆积，加之胞外基质增加及纤维化，导致管壁弹性下降，血管阻力增大，使血流变慢、局部血液粘度增高，易形成血栓，阻塞血管。这些构成了脑血栓、出血、冠心病及心肌梗塞等疾病的重要发病基础。因此，寻找拮抗LPS诱导的VSMCs增殖的药物，在防治动脉粥样硬化病变方面有较好的应用前景。

    吡格列酮和罗格列酮是临床上广泛应用的噻唑烷二酮类药物（TZDs），作为胰岛素增敏剂，它是过氧化物酶增殖物激活受体γ（PPARγ）激活剂。曾认为PPARγ仅存在于脂肪细胞,参与调节脂肪细胞分化和脂肪酸代谢基因的表达。但近年的大量研究发现PPARγ在多种心血管细胞,包括心肌细胞、心肌成纤维细胞、单核/巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等都有不同程度的表达［6］。目前研究发现，此类药物不仅能直接改善胰岛素抵抗，增加机体对胰岛素的敏感性，并且可改善冠心病危险因素，对血管细胞也有直接作用［7］，并且能抑制球囊损伤后的新生内膜的形成，抑制低密度脂蛋白受体缺乏大鼠AS的进程［8］。本研究发现吡格列酮和罗格列酮低浓度就对LPS刺激VSMCs增殖有抑制作用，罗格列酮的作用略微高于吡格列酮。我们认为噻唑烷二酮类药物通过对VSMCs的作用，能延缓、减轻AS,尤其对于糖尿病患者防治心脑血管并发症有重要意义。

    综上所述，我们得出结论，LPS可促进大鼠VSMCs增殖，吡格列酮和罗格列酮可明显抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞增殖。噻唑烷二酮类药物可能成为心血管疾病的一个新的靶点，对其作用机制的深入研究对相关疾病的防治具有重要的理论意义。

【】
  1 马丽琴,谷振勇,董国凯, 等. cck-8调节LPS诱导大鼠血管平滑肌细胞iNOS表达的分子机制 急救医学, 2006,26 (10) :33～35.

2 Sidhu J S,Kaski J C. Peroxisome proliferator activated receptor gamma:a potential t herapeutic target in t he management of is2 chaemic heart disease.Heart,2001,86:255～258.

收稿日期：2008-08-24

3 司徒镇强，吴军正.细胞培养.西安:世界图书出版社，1999，107.

4 Ross R.　Atherosclerosis——an inflammatory disease.　N Engl J Med,1999,340 (2):115～126.

5 王笑梅,司良毅. 内毒素对大鼠动脉粥样硬化病灶的影响及TLR4的作用.第三军医大学学报，2006，28(23)：2368～2370.

6 姚园. 过氧化物酶体增殖物激活受体γ的心血管保护作用. 岭南心血管病杂志，2006，12（6）：445～448.

7 Marx N,Walcher D,Ivanova N,et al.Thiazolidinediones reduce endothelial expression of receptors for advanced glycation end products.Diabetes，2004，53（10）:2662～2668.

8 Neve BP,Fruchart JC,Staels B.