三七皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及相关基因表达的影响

【摘要】  目的：研究三七皂苷(PNS)对脑缺血再灌注后大鼠脑海马和皮质形态学变化、Bcl?2、Bax蛋白表达及神经细胞凋亡的影响。方法：采用线栓改良法复制大鼠左侧大脑中动脉闭塞(MCAO)建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型，缺血2小时，再灌注24小时。将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、三七皂苷组、尼莫地平组和三七皂苷加尼莫地平组（联合用药组），每组10只。分别采用HE染色检测大鼠脑组织皮质和海马区病理改变，TUNEL法检测各组脑内皮质和海马区细胞凋亡变化，免疫组化染色观察各组大鼠脑内皮质和海马区Bcl?2 、Bax蛋白表达。结果：与模型组相比，三七皂苷组、尼莫地平组、联合用药组大鼠光镜下细胞损伤变性程度轻；细胞凋亡率下降（P均<0.01），三七皂苷组与尼莫地平组相比，细胞凋亡率无显著性差异（P>0.05），与联合用药组相比，有显著性差异（P<0.01）；与模型组相比，三七皂苷组、尼莫地平组、联合用药组大鼠缺血区皮质和海马Bcl?2阳性细胞数均明显上升（P均<0.01），Bax阳性细胞数的表达在相同时间点减少（P均<0.01）。结论：三七皂苷可抑制大鼠神经细胞凋亡，对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定保护作用,其机制可能与Bcl?2表达增高,Bax表达降低有关。

【关键词】  大 鼠 脑缺血再灌注 细胞凋亡 Bcl?2 Bax 三七皂苷

缺血性中风是最常见的脑血管疾病，缺血再灌注损伤所致神经细胞凋亡已被证实,但其发生机制仍未完全明确。三七为五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng(Burk) F.H.Chen的根，主要活性成分是三七总皂苷(Panax notogi?noside,PNS),其块根中含皂苷约12%[1]。三七在缺血缺氧性脑损伤防治中广泛应用,但其对脑缺血再灌注后海马和皮质神经细胞凋亡及Bcl?2、Bax表达的影响报道较少。本实验通过观察三七皂苷对脑缺血再灌注大鼠缺血侧皮质和海马区细胞凋亡及Bcl?2、Bax蛋白表达的影响，探讨其抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

    1  实验材料

    1.1  动物及分组  健康SD大鼠50只,雌雄不拘，清洁级，体重250～300g，由中英合资上海西普尔—必凯实验动物有限公司提供[动物许可证号：SCXK（沪）2003?0002]，饲养于上海中医药大学附属普陀动物房[动物实验室许可证号为SYXK（沪）2005?2008]。大鼠经普通饲料适应性喂养1周后，随机分为模型组、假手术组、三七皂苷组、尼莫地平组、三七皂苷合尼莫地平组（联合用药组）,每组10只。

    1.2  药物及试剂  三七皂苷注射液（昆明制药集团股份有限公司，商品名：血塞通注射液，规格：250mg/5ml/支），尼莫地平注射液（德国拜耳医药保健股份公司,规格：10mg/50ml/支）；免疫组化检测试剂盒Bcl?2、Bax抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），TUNEL试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）。

    1.3  主要仪器  LeicaRM20型石蜡切片机，Philips Tecnai?12Biotwin型显微镜，MIQAS型病理图像分析仪，SD?78双极电凝器。

    2  实验方法

    2.1  给药方法及剂量  根据人体临床用药剂量换算大鼠用药剂量（相当于人体用药量的6.3倍）。三七皂苷组给予三七皂苷45mg/kg；尼莫地平组给予尼莫地平20mg/kg；联合用药组给予三七皂苷45mg/kg，加尼莫地平20mg/kg；假手术组和模型组给予相同体积的生理盐水。造模前6天给予腹腔注射上述剂量药物,第7天给药30 min后造模,1天1次，造模后2小时给药1次。给药期间常规自由喂养、给水。

    2.2  大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制备及筛选

    2.2.1  模型制备  采用改良Longa[1]线栓法制备模型。腹腔注射10%戊巴比妥钠(0.2ml/100g)麻醉，背位固定大鼠后，剃除颈部体毛，局部消毒。切开颈正中皮肤3cm，暴露左侧颈总动脉(CCA)，自CCA分叉处向头端依次游离，双极电凝器烫掉颈外动脉(ECA)的细小分支，然后在颈外动脉距颈总动脉分叉0.5～1cm处结扎，切断ECA，并使其游离并套线备用。分离颈内动脉(ICA)至颅底,分离其分支翼腭动脉，如不分离夹闭，尼龙线可能进入这个分支。用动脉夹暂时夹闭左侧CCA和翼腭动脉,用弹簧剪在游离的ECA残端剪0.2mm小口,将预先制备好的4?0的强生尼龙线(直径0.20mm,长50mm)入ECA残端小口内,将尼龙线缓慢沿ICA向颅内推进,进线约22mm,略感阻力，证明栓线头端已达到大脑前动脉,阻断了大脑中动脉的所有血液来源，包括来自颈内动脉、大脑前动脉、大脑后动脉的血流，缝合切口。将尼龙线留置2个小时后，再灌注24小时将栓线抽出约10mm,拔线时有脱空感即止，将远端剪断10mm，以防动物苏醒后将线栓抓脱，导致大出血死亡。假手术组仅做颈动脉分离。

    2.2.2  动物模型成功标准  动物苏醒后，观察缺血动物的神经功能缺失症状。按Longa 5分制评分:0分，无明显神经病学症状；1分，不能完全伸展对侧前肢；2分，向对侧旋转；3分,行走时向对侧倾倒；4分，不能自行行走，有意识障碍。0、4分弃之不用,其他即为成功模型。

    2.3  标本取材  再灌注24小时后过量麻醉，迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管后灌注生理盐水250ml剪开右耳,快速冲洗，再用4%多聚甲醛250ml灌注,直到头部变硬,断头取脑,取视交叉前后约20～30mm范围的冠状切片，放入10%福尔马林中固定，24小时之内石蜡包埋。

    2.4  大脑皮质和海马病观察  脑组织经10%福尔马林固定、脱水、石蜡包埋，切片3μm厚度,常规HE染色,光镜下观察。

    2.5  免疫组化染色法  切片脱蜡置新鲜配置的3%H2O2，室温处理20min以灭活内源性过氧化物酶。将切片浸入0．01MPBS缓冲液中轻微振荡洗涤3次，每次5min。滴加复合消化工作液至切片上，室温孵育20min；以修复液 Ⅰ 覆盖组织切片20min，使抗原充分暴露。将切片浸入0．01MPBS缓冲液中轻微振荡洗涤3次，每次5min。滴加封闭液 Ⅰ，室温处理20min后洗涤。滴加特异性一抗(bcl?2，1∶100)。37℃湿盒孵育2小时。0．01MPBS缓冲液中轻微振荡洗涤3次，每次5min。滴加封闭液Ⅱ，室温处理20min，0．01 MPBS缓冲液中轻微振荡洗涤3次，每次5min。滴加特异性生物素化二抗(1∶100)，37℃湿盒孵育2小时。0．01MPBS缓冲液中轻微振荡洗涤3次，每次5min。滴加SABC过氧化酶复合物，4℃湿盒过夜。0．01MPBS缓冲液中轻微振荡洗涤3次，每次5min。滴加DAB?H2O2显色液显色。苏木素轻度复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，树脂封片。

    实验用PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照，以细胞浆棕黄色为阳性。采用图像分析仪，每组分析10个标本，每张切片在200倍光镜下随机选取5个不重叠的视野计皮质和海马区阳性细胞数，取平均值。

    2．6  TUNEL细胞凋亡检测  将石蜡包埋标本行冠状切片，厚3μm，按试剂盒说明书进行操作。光镜下凋亡细胞核呈棕色。每张切片在200倍光镜下随机选取5个不重叠的视野，输入机进行图象分析，计算每个视野的凋亡细胞个数和正常细胞数，计算出细胞凋亡指数，取平均值。

    2．7  统计学方法  所有数据用SPSS 13．0统计软件分析处理，实验数据以（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析(ANOVA检验)，方差齐者组间比较用LSD检验，方差不齐者用Games?Howe 11检验，P<0．05表示有统计学意义。

    3  实验结果

    3.1  脑组织HE染色形态学观察  假手术组缺血侧皮质和海马区偶见缺血坏死灶,细胞轮廓清楚,细胞排列整齐，胞核清晰,呈蓝色，核仁可见;模型组缺血侧额顶叶皮质和海马区可见轻度缺血坏死灶，有少量的细胞坏死变性，细胞核固缩、深染,甚者核溶解变形；三七皂苷组、尼莫地平组及联合用药组亦可见凋亡细胞，细胞轻度肿胀、皱缩,核仁可见。

    3.2  各组大脑海马和皮质bcl?2的表达  假手术组大鼠海马可见少量Bcl?2蛋白表达，主要存在于胞质,无明显核表达；模型组缺血侧Bcl?2有较多的阳性表达，阳性细胞清晰可见，细胞浆呈棕黄色染色，与假手术组比较，有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，三七皂苷组、尼莫地平组、联合用药组大鼠缺血区皮质和海马Bcl?2阳性表达均明显增加（P均<0.01）；三七皂苷组与尼莫地平组比较，差异有显著性意义（P<0.05），见表1。

    3.3  各组大脑海马和皮质Bax表达  Bax蛋白表达阳性细胞胞浆呈棕黄色染色。假手术组大鼠海马区和皮质可见少量Bax阳性细胞，模型组海马区和皮质Bax的阳性表达明显高于假手术组（P<0.01）；与模型组比较，三七皂苷组、尼莫地平组、联合用药组大鼠海马区和皮质Bax阳性表达明显减少（P<0.01）；三七皂苷组与尼莫地平组间差异无统计学意义（P>0.05）。三七皂苷组与联合用药组之间差异有统计学意义（P<0.01），见表2。表1  各组海马和皮质Bcl?2蛋白表达

    与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01；与尼莫地平组比较，▲P<0.05；与三七皂苷组和尼莫地平组比较，#P<0.01表2  各组大脑海马和皮质Bax表达（±s）平均阳性细胞数

    3.4  各组脑组织细胞凋亡情况  假手术组脑组织TUNEL染色偶见凋亡细胞，模型组脑组织中可见大量凋亡细胞。光镜下凋亡细胞表现为胞核被染成淡棕色。结果显示，脑缺血再灌注24小时后，模型组神经细胞凋亡率明显高于假手术组，差异有显著性意义(P<0.01)；三七皂苷组、尼莫地平组及联合用药组细胞凋亡率下降，与模型组比较，差异有显著性意义(P均<0.01)；三七皂苷组与尼莫地平组比较，差异无显著性意义(P>0.05)，与联合用药组比较，差异有显著性意义(P<0.01)，见表3。表3  各组脑组织细胞凋亡情况

　　4  讨  论

    随着对脑缺血损伤机制研究的日益深入，细胞凋亡(apoptosis)在脑缺血再灌注中的作用引起关注。研究表明，神经细胞凋亡是缺血性脑损伤后细胞死亡的重要形式[3]。

    细胞凋亡受多种相关基因及其蛋白调控,其中Bcl?2 家族是目前最受重视的凋亡相关基因家族[4]。Bcl?2家族既能阻抑坏死又能阻抑凋亡[5],Bcl?2 家族包括Bcl?2、Bcl?x、Bax、mcl?1、AL。一般认为，Bcl?2基因家族是一种重要的内源性抗凋亡因子，对维持脑缺血再灌注后某些神经细胞的生存有重要作用。Bax蛋白存在于胞浆，是一种跨膜蛋白，含有192个氨基酸，与Bcl?2具有21％的同源性，其生物学作用是拮抗Bcl?2。

    三七具有化瘀止血、活血定痛之效。《本草纲目》记载该药可散血、止血、定痛。药理研究认为，三七活性成分为三七总皂苷(PNS),具有扩张微细血管,降低血管阻力,增加脑血流量,降低血液黏度,抑制血栓形成等作用。本实验结果显示,HE染色光镜下观察，三七皂苷组脑组织损伤程度均较模型组轻,免疫组化染色结果表明,模型组Bcl?2有表达，Bax与之相反,与报道相符。三七皂苷与尼莫地平作用相似或略强,无显著性差异，联合用药组则效果略好。对大鼠大脑皮质和海马进行细胞凋亡检测结果表明，三七皂苷能抑制皮质和海马神经元凋亡，对脑神经细胞具有保护作用。其作用机制可能与三七皂苷上调脑缺血再灌注诱导的Bcl?2 蛋白表达,同时下调Bax 蛋白表达有关。联合用药组效果略好，提示联合用药可能是防治脑缺血再灌注损伤的一种思路。

【文献】
  1 马 珂.三七皂苷的实验研究进展.浙江中西医结合杂志,2002，12（3）:197?198

2 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke,1989, 20(1):84?91

3 Ferrer I, Planas AM. Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia :life and death struggle in the penumbra. Neuropathol Exp Neurol, 2003,62:328?339

4 Graham SH,chen J, Clark RS. Bcl?2 family gene products in cerebral ischemia and traumatic brain injury. J Neurotrauma, 2000,17(10):831?841

5 Wei MC, Zong WX,Cheng EHY, et al. Proapoptotic BAX and BAK：areguisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science,2001,292(5517):727?730