人子宫蜕膜树突状细胞 DEC-205+HLA-DR+CD11c+的分离纯化与鉴定
作者：祝文峰 袁建辉 曾国琼 李红梅
【摘要】 目的：探讨人子宫蜕膜树突状细胞的分离方法和诱导培养的最佳条件，为研究树突状细胞在母胎免疫耐受中 的作用奠定基础。方法：人早孕（7~12 周）子宫蜕膜组织经机械破碎，梯度离心获得蜕膜低密度细胞，经粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干细胞因子（SCF）诱导，所获得细胞用 FITC 标记的抗人 DEC-205、HLA-DR、CDllc 抗体进行鉴定。结果：从蜕膜组织可获取足够数量蜕膜树突状细胞，体外培养 10~18 d 细胞生长较为活跃，第 14 天左右达到最高值，维持 3~4 d 开始下降，20 d 内细胞数仍能维持在（1.0~2.3）×105 个/mL。结论：梯度离心法能成功分离蜕膜树突状前体细胞，GM-CSF 和 SCF 体外诱导可提供蜕膜树突状细胞原代培养较为满意的生长条件。
【关键词】 妊娠；免疫耐受；蜕膜；树突状细胞；分离和纯化
〔Abstract〕 Objective To investigate the separation methods and growth conditions of decidual dendritic cells, and establish the ground work for the research of dendritic cell's functionary mechanism in maternal immunity and tolerance to the fetus. Methods The fresh early gestation (7~12 wk gestation) decidual tissue was dispersed mechanically in Hank'S balanced salt solution, and the low density cells were obtained by gradient centrifugation and cultured with granulocytemacrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and stem cell factor (SCF). Then the generated cells were identified by phenotypic and functional methods. Results A total of 1.0~2.3×105 decidual dendritic cells were obtained from the fresh decidual tissue. These cells grew vigorously within 10~18 days and reached the peak at the 14th day. Conclusion The method of echanically, gradient centrifugation can successfully separate the decidual dendritic cells. GM-CSF and SCF can promote the growth of the decidual dendritic cells and provide satisfactory growth conditions for them.
〔Key Words〕 Gestation; Immunity and tolerance; Deciduas; Dendritic cells; Separation and purification
正常妊娠有赖于母体和胎儿间的免疫平衡。正常妊娠时，母体免疫系统以 Th2 型免疫应答为主，保护胚胎乃至胎儿胎盘不被母体排斥，维持母体对胎儿的免疫耐受。研究表明[1]，树突细胞对母体免疫耐受的启动起着重要作用，发现早孕期蜕膜中存在 HLA-DR+lin- 的树突细胞，并认 DEC-205+ 可作为蜕膜树突状细胞的标志。本研究采用密度梯度离心法成功分离了人早孕子宫蜕膜树突状细胞，并用粒－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干细胞因子（SCF）诱导其大量生长，为后续研究树突状细胞在母胎免疫耐受中的作用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
人早孕（7~12 周）子宫蜕膜组织（本院门诊要求终止妊娠的组织标本）。D-Hanks' （平衡盐溶液），配制方法见[2]，高压灭菌备用；细胞分离液：3% Ficoll（菲科尔）/10% 泛影葡铵；RPMI 1640 （细胞培养液，Sigma 公司），使用前加入青霉素、链霉素（100 U/mL、100 U/mL）、10% 小牛血清；50 g/L GM-CSF（粒-巨噬细胞集落刺激因子，华美公司）；20 g/L 干细胞因子（SCF，华美公司）。抗人 DEC-205、HLA-DR 和CD11c（1:200，博士德公司）。
1.2 方法
1.2.1 蜕膜树突状细胞分离和培养 无菌切除的新鲜蜕膜组织用 D-Hanks' 液冲洗 2 次，置入消毒后的组织匀浆器中，加入 D-Hanks' l0 mL 制成匀浆，200 目金属网过滤，20℃、100×g 离心 60 s，弃上清，小心地将蜕膜细胞悬液加入含 10 mL 细胞分离液的离心管液面上，20℃、200×g 离心 20 min。收集上层低密度细胞[3]。调节细胞密度为 5×105 个/mL，取 2 mL 加入 6 孔培养板，补加 RPMI-1640 培养液 2 mL，37℃，5％ CO2 培养箱中进行培养，间隔 3~4 d 半量更换细胞培养液。实验分对照组、50 g/L GM-CSF 组、20 g/L SCF 组和 50 g/L GM-CSF+20 g/L SCF 组，加入相应浓度的刺激因素。
1.2.2 细胞观察及鉴定 每 24 h 行细胞计数，制作生长曲线，倒置显微镜观察细胞形态及细胞生长情况。用蜕膜树突状细胞特异性标记物抗人 DEC-205-FITC、HLA-DR-FITC 和 CD11c-FITC 抗体通过免疫荧光染色方法来鉴定上述培养细胞，观察其表达情况。
2 结 果
2.1 蜕膜细胞制备和分离
采用机械破碎，金属网过滤，梯度离心法，能获取足够的蜕膜树突状前体细胞，数量达 1.0~2.3×107，满足蜕膜树突状细胞原代细胞培养的需要。
2.2 细胞生长曲线
见图 1。蜕膜细胞接种后，数量均有一明显下降，第 5 天达最低值，可能是细胞悬液中蜕膜细胞死亡所致。体外培养 10~18 d 蜕膜树突状细胞生长较为活跃，第 14 天左右细胞数达到最高峰值，维持 3~4 d 后开始下降，但 20 d 内细胞数仍可维持较高水平。在细胞培养液中加入 GM-CSF、SCF 诱导后与对照组比较，蜕膜树突状细胞数量均有不同程度增加；其中二者合用诱导后蜕膜树突状细胞数量增加最为明显；三者在培养 10~18 d 均能获得足够数量（1.0~2.3×105/mL）蜕膜树突状细胞。
2.3 蜕膜树突状细胞的形态和生长变化
倒置显微镜观察蜕膜树突状细胞体外培养最初呈圆形或卵圆形，7~9 d 后出现典型分裂相，胞质内可见二倍体核型；10~11 d 细胞分裂旺盛，相互聚集有贴壁现象；14 d 左右细胞贴壁，胞膜向外延伸出尖状突起，胞质中见圆形或卵圆形细胞核，细胞生长呈簇状聚集，此状态可持续到第 18 天左右。此后细胞分裂逐渐减慢，活细胞开始离解和死亡，至第 21 天左右细胞明显减少，第 28 天细胞完全死亡。形态学观察表明：原代培养的蜕膜树突状细胞在10~18 d 生长和分裂能力很强，此后逐渐衰退，最长可达 28 d。
2.4 蜕膜树突状细胞鉴定
免疫荧光观察显示为阳性反应，即所培养的细胞是蜕膜树突状细胞 DEC-205+HLA-DR+CD11c+。
3 讨 论
妊娠以后母体免疫系统发生若干变化，如Th1/Th2 系统向 Th2 偏移，NK 细胞毒性下降 CD4+ CD25+ 调节性 T 细胞增多[4]等，母胎界面也形成了免疫耐受的微环境。可见母胎免疫耐受不是被动的不识别胚胎抗原，而是一个主动识别和耐受的过程。而母体对胚胎抗原的识别必然离不开抗原递呈细胞—树突细胞。因此，树突细胞对母体免疫耐受的启动起着重要作用。Gardner 等[1]对人蜕膜中树突细胞的表型和分布进行了研究，发现在早孕期蜕膜中存在 HLA-DR+lin-（即 CD3-CD19-CD14-CD56-CD16-）的树突细胞，并且为未成熟型，主要特点为 HLA-DR+CD11c+DEC-205+CD40+DC-sign-CD1α-CD123-，并认为 DEC-205+ 可作为蜕膜树突细胞的标志。免疫组化显示 DEC-205+ 的树突样细胞散在分布于蜕膜中，在种植部位可见其与滋养细胞很接近。Blois 等[5] 对孕鼠子宫局部及外周血中的树突细胞在孕期的变化进行研究发现：①CD11c+ 树突细胞在孕 5.5 d 开始上升，8.5 d 达高峰，9.5~17.5 d 为平台期。②在子宫局部只有 < 30% 的树突细胞表达 MHCⅡ类分子，表明大部分的树突细胞处于非成熟状态，并且在孕 5.5~8.5 d，MHCⅡ类分子的表达明显下降，其表型也转为分泌 Th2 型细胞因子的 CD8α- 树突细胞，提示树突细胞可能在胚胎抗原的耐受中起重要作用，但是目前尚缺乏直接证据。关于树突细胞在母胎免疫耐受中的作用还有很多未知。
要研究树突状细胞在母胎免疫耐受中的作用，需要进行树突状细胞的原代培养。而要将蜕膜树突状前体细胞从中分离出来较为困难。国外报道组织树突细胞的分离方法主要有两种：体外组织培养和流式细胞仪分选[6，7]。前者分离纯度低，后者程序复杂且消耗大量抗体，均不能快速简便地获取树突细胞。本研究采用的方法简便、高效、重复性好，能够满足蜕膜树突状细胞原代培养的需要，是一种较为成功的蜕膜细胞分离方法。我们还对蜕膜树突状细胞体外培养最佳条件进行了探讨。在 RPMI-1640 培养液中，蜕膜树突状细胞生长缓慢，加入 GM-CSF 和 SCF 诱导后，可促使蜕膜树突状前体细胞向成熟蜕膜树突状细胞转化，细胞生长活跃，对数生长期提前并延长，细胞数量较对照组大幅度增加，在培养第 10~18 天均能达到 1.0~2.3×105，满足后续实验的需求，便于相关课题研究的深入开展。
【文献】
〔1〕Gardner L, Moffett A. Dendritic cells in the human deciduas 〔J〕. Biology of reproduction, 2003, 69:1438-1446
〔2〕蔡文琴, 王伯云. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术〔M〕. 成都:四川省科技出版社, 1994. 496
〔3〕Hill ME, Ferguson DJ, Austyn JM, et a1. Potent immunostimulatory dendritic cells can be cultured in bulk from progenitors in nol'l12al infant and adult myasthenic human thymus〔J〕. Immunology, 1999, 97:325-332
〔4〕Aluvihare VR, Kallikourdis M, Betz AG. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus〔J〕. Nature immunology, 2004, 5(3):266
〔5〕Blois SM, Alba Soto CD, Tometten M, et al. Lineage, maturity, and phenotype of uterine murine dendric cells throuth gestation indicate a protective role in maintaining pregnancy〔J〕. Biology of reproduction, 2004, 70:1018-1023
〔6〕Vremec D, Zorbas M, Scolay R. The surface phenotype of dendritic cells purified from mouse thymus and spleen: investigation of the CD8 expression by a subpopulation of dendritic cells〔J〕. J Exp Med, 1992, 16:47-54
〔7〕Winkel K, Sotzik F, Vremec D, et a1. CD4 and CD8 expression by human and mouse thymic dendritic cells〔J〕. Immunol Lett, l994, 40:93-99
