川芎嗪对癫痫模型海马内信号分子的影响

【摘要】  目的：研究戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）点燃癫痫模型大鼠海马内环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP）、环-磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate, cGMP）的变化及川芎嗪（Tetramethylpyrazine, TMP）对其的影响。方法：将实验动物随机分为 3 组，正常对照组、癫痫模型组、TMP 组。采用放射免疫法测定海马内 cAMP、cGMP 的含量。结果：模型组与正常对照组比，cAMP、cGMP 含量明显增加， cAMP/cGMP 比值明显减小，差异均具有显著性意义 （P < 0. 01），TMP 治疗组与癫痫模型组比，cAMP 含量明显增加，cGMP 含量则明显减少，cAMP/cGMP 比值明显增加，差异均具有显著性意义（P < 0. 01）。结论：川芎嗪抑制癫痫放电作用与其调节海马内 cAMP、cGMP 含量变化有关。

【关键词】  川芎嗪；海马；癫痫；环-磷酸腺苷；环-磷酸鸟苷；放射免疫

    〔Abstract〕  Objective  To  study  the  effect  of  tetramethylpyrazine  (TMP)  in  treating  epilepsy  and  its  relation　to  signaling  molecule  in  hippocampus  of  rats.    Methods     Experimental  animal  were  selected  and  randomized  into  three  groups:  normal  saline  control  group,  pentylenetetrazol  group  and  treatment  of  tetramethylpyrazine  group,and  the  changes  of  the  content  of  cAMP、cGMP  in  hippocampus  of  rats  were  detected  using  radioimmunity method.    Results     The  content  of  the  cAMP、cGMP  in  hippocampus  in  pentylenetetrazol  groups  were  significantly  higher  than  those  in  saline  control  groups.  While  the  proportionality  in  pentylenetetrazol  groups  were significantly  lower  than  those  in  saline  control  groups  (P  <  0.01).  The  content  of  cAMP  in  hippocampus  in  those  intreatment  of  tetramethylpyrazine  groups  were  significantly  higher  than  those  in  pentylenetetrazol  groups.  While  the  content  of  the  cGMP  in  hippocampus  in  intreatment  of  tetramethylpyrazine  groups  were  significantly  lower  than  those  in  pentylenetetrazol  groups  (P  <  0.01).  The  proportionality  in  pentylenetetrazol  groups  were  significantly  higher  than  those  in  saline  control  groups  (P  <  0.01).    Conclusion 　Tetramethylpyrazine  inhibit  epilepsy  discharge  may  be  its  regulation  the  content  of  cAMP、cGMP  in  hippocampus.

    〔Key  Words〕    Tetramethylpyrazine  (TMP);  Hippocampus;  Epile;  cAMP;  cGMP;  Radioimmunity

    　　癫痫（epilepsy, EP）是以脑部神经元过度放电所致的突然反复和暂时性的中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病，严重危害人类健康，其发病机制一直是国内外研究者关注的焦点，但目前仍不清楚，所以至今尚未找到一种理想的根治手段。川芎嗪为中药川芎的有效成分，化学结构为四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine, TMP），大剂量的 TMP 对缺血、缺氧性脑损伤，海马 Ca1 神经元的缺血性损伤有改善和保护作用[ 1，2 ] 。笔者以往的实验研究证明[3-5]：TMP 能够抑制大鼠癫痫放电，对大鼠癫痫模型神经细胞的损伤具有保护作用。本实验旨在观察TMP 对癫痫大鼠海马内环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）含量的影响，以探讨 TMP 抑制大鼠癫痫放电的机制，从而为临床治疗癫痫提供理论依据。

    1    材料与方法

    1.1    材料

    1.1.1    实验动物    SD 大鼠（由广州医学院实验动物中心提供）30 只。雌雄不拘，体重 160~200 g。

    1.1.2    试剂及药品    川芎嗪注射液（Tetramethylpyrazine, TMP, 40 mg/2 mL，北京第四制药有限公司）。戊四氮（PTZ, Sigma 公司）用前以 9 g/L 氧化钠溶液配制成溶液，浓度为 2.5 mg/mL，置冰箱内备用。试剂盒（购自上海中医药大学）。

    1.1.3    实验仪器    EL-2001 型免疫计数器（陕西省西安 262 厂生产）。

    1.2    方法

    1.2.1    实验癫痫模型的复制    根据 [6]，复制癫痫模型用 PTZ 亚惊厥剂量（32 mg/kg），每日 1 次，腹腔注射，持续 28 d 后停药 7 d，再用相同剂量的 PTZ 测试，凡显示连续 5 次 2 级以上惊厥的大鼠为达到点燃标准。大鼠惊厥发作评分标准：O 级：没有行为上的发作；Ⅰ级：节律性点头或头部颤搐； Ⅱ级：阵挛性咀嚼； Ⅲ级：头部颤搐加前肢阵挛性抽搐； Ⅳ级：袋鼠姿势（上身直立）； Ⅴ级：跌倒；Ⅵ级：强直性惊厥。正常对照组给予相同剂量的 9 g/L 氧化钠溶液腹腔注射，持续 28 d。

    1.2.2    实验动物分组及给药    将 10 只 SD 大鼠随机分为 3 组，每组 10 只，即正常对照组，癫痫模型组及川芎嗪组。其中癫痫模型组、TMP 治疗组选自 PTZ 点燃癫痫模型复制成功的大鼠。正常对照组、癫痫模型组以双蒸水 0.01 mL/g 灌胃，每日 1 次，持续 7 d；TMP 治疗组每日按 800 mg/kg 剂量灌胃，每日 1 次，持续 7 d。

    1.2.3    cAMP、cGMP 测定    以上各组给药 7 d 结束后，除正常对照组外，其他两组用 PTZ 点燃测试 1 h 后，断头取脑组织，分离海马（包括海马、齿状回和下托），取海马标本 50 mg 加入 2 mL 冷的 50 mol/L、pH 值为 4.76 的醋酸缓冲液中，立即冰浴匀浆，悬浮液加入 950 mL/L 乙醇 2 mL，静置 5 min， 3 500 r/min，离心 10 min，收集上清液，再用 750 mL/L 乙醇 2 mL 洗沉淀物，混匀，3 500 r/min，离心 10 min，合并上清液，60 ℃烘箱中烤干。再放射免疫法测定cAMP、cGMP 浓度。

    1.2.4    统计学处理    本实验数据均以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用成组 t 检验。

    2    结    果

    各组大鼠海马内 cAMP、cGMP 含量变化模型组与常对照组比，cAMP、cGMP 含量明显增加， cAMP/cGMP 比值明显减小，差异均具有显著性意义（P < 0. 01），TMP 治疗组与癫痫模型组比，cAMP 含量明显增加，cGMP 含量明显减少，cAMP/cGMP 比值亦增加，接近正常，差异均具有显著性意义（P < 0. 01）。见表 1。

    3    讨    论

    点燃癫痫动物模型的形成是给予动物脑组织一种持续的、低于惊厥量的刺激化学的或物理的，当刺激积累到一定程度，同样的亚惊厥量，便能诱发动物癫痫的发生。由于这种模型的形成过程，极大程度的模拟了多数人类癫痫的形成，如外伤性癫痫系外伤导致瘀血或疤痕遗留在脑组织中，对周围组织形成刺激源，经过一段时期的刺激后，便导致癫痫发作，而某些脑部疾病如脑炎、脑膜炎、脑肿瘤后遗症并发癫痫，亦是有某一病灶作为刺激源，不断刺激脑组织的结果。因此，点燃癫痫模型对研究癫痫的发病机制及药物治疗机理是最为理想的模型[7]。环核苷酸（cAMP、cGMP）是中枢神经系统细胞的“第二信使”，对中枢神经系统活动起重要调节作用。cAMP、cGMP 对中枢神经调节作用是相互对应并相互关联的，体内 cAMP、cGMP 保持一定比例，得以维持中枢神经系统正常放电过程，而比例发生改变时出现异常兴奋或抑制，发生异常放电，产生癫痫。关于环核苷酸在中枢神经系统内参与癫痫与发病机制的研究，已有较多的实验证明，动物癫痫及人类癫痫均可明显影响脑内环核苷酸水平[8，9]。TMP 在体内有广泛的抑制效应，且有抑制缺血、抗再灌所致心律失常的作用，TMP 通过抑制内皮素-1 （ET-1）引起的冠脉血管收缩和缺血性改变，而实现其抗心肌缺血作用。TMP 对缺血再灌所致的心功能损伤有较好的保护作用，TMP 对 α1-1 肾上腺素受体有竞争抑制作用[10]。本实验结果显示 TMP 能够使癫痫大鼠海马内 cGMP 含量明显下降，而 cAMP 含量进一步增加，表明 TMP 对癫痫大鼠海马内 cAMP、cGMP 含量有一定的调节作用。有研究表明，脑内cAMP 含量的进一步增加，反作用于细胞膜，改变膜通透性，减弱神经兴奋性，使发作停止或减弱，因而提高脑内 cAMP 水平而可能有抗癫痫作用[11] 。cAMP/cGMP 比值的病理改变与癫痫发生、、转归有密切关系。本实验结果亦显示 TMP 在升高大鼠脑内 cAMP 降低 cGMP 的同时，使 cAMP/cGMP 比值恢复正常。所以，TMP 抑制大鼠癫痫放电的作用机制可能与调节 cAMP 及 cGMP 含量有关。

【】
  〔1〕NI JW, Matsumoto K, Watanabe H. Tetramthylpyrazine improve spatial cognitive impairment induced by permanent occlusion of bilateral common carotid arteries or scopolamine in rats〔J〕. Jpn J Pharma-col, 2005, 67(2): 137-141

〔2〕 Luo XX, Ogata H, Xu X, et al. Protective effect of tetramthylpyrazine on ischemic neural damage in the qerbyl hippocampns〔J〕. Jpn J Pharma-col, 2005, 46(9):841-846

〔3〕 朱晓琴, 胡祁生, 张端莲, 等. 川芎嗪对大鼠癫痫放电的影响〔J〕. 青海医药杂志, 2002, 32(9):1-3

〔4〕 Zhu Xiaoqin, Zheng Yanfang, TangXingsan, et al. Influence of ligustrazine on neuronal structure in brain of epileptic rats〔J〕. 临床康复, 2005, 9(25):236-237

〔5〕 ZhuXiaoqin, Yu Xiaoqin, Lei Shuisheng, et al. Effect of tetramethylpyrazine on Nissl bodies in cerebral neurons of rats with epilepsy〔J〕. 中国临床康复, 2005, 9(29):232-234

〔6〕 钱会南, 王洪图, 齐治家, 等. 调理脾胃复方对PTZ点燃癫痫模型阿片肽含量的影响〔J〕. 北京中医药大学学报, 1999, 2291:35-36

〔7〕 韩济生. 神经纲要〔M〕. 北京:中国协和医科大学联合出版社, 1993. 861

〔8〕 裴印权. 惊厥和抗癫痫药对中枢神经内环核苷酸的影响〔J〕. 生理科学进展, 1993, (3):269

〔9〕 谢安木, 迟兆富, 尚伟, 等. 苯多英钠对实验性癫痫cAMP、 cGMP的影响〔J〕. 卒中与神经疾病, 1998, 5(3):139-141

〔10〕王质育, 关超然, 陈孟勤. 川芎嗪对心血管系统的作用〔J〕. 生理科学进展, 1992, 23(4):313

〔11〕解学孔. 癫痫病学〔M〕. 北京:人民卫生出版社, 1995, 92-93