甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达
作者：杨靖 ， 张卫东， 曹康， 蒋中华， 李虹， 李明远
[摘 要] 目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，用特异引物进行RT－PCR，扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中，通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性，可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成，被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗，通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。
[关键词] 甲型流感病毒；M2基因；真核表达载体； 免疫荧光技术
Abstract:Objective To construct eukaryotic expression plasmid containing M2 gene from influenza A virus , transfer it into HEK293 eukaryotic cell line and detect the expression of target protein.Methods RNA was extracted from allantoic fluid of chicken embryo inoculated with influenza A virus A/PR/8/34. M2 gene was amplified by RT-PCR with specific primer and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) for constructing the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-M2. Then the recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells with PolyFect Transfection Reagent after identification by restriction enzyme analysis, PCR and sequencing analysis.Results Restriction enzyme identification, PCR and sequencing analysis demonstrated that the M2 gene was successfully cloned and inserted into pcDNA3.1(+). Immunofluorescence assay confirmed that the M2 gene could be expressed in HEK293 cells.Conclusion M2 protein of influenza A virus is a kind of highly conserved protein in amino acid sequence and its ion channel activity can affect the structural stabilization of haemegglutinin (HA) of influenza virus. So the study provides a basis for exploring genetic engineered vaccine，DNA vaccine and broad-spectrum vaccine for influenza A virus.
Key words:influenza virus; M2 gene; eukaryotic expression vector; immunofluorescence assay
1933年Smith等人首先用雪貂分离出甲型流感病毒，确定了流感病毒的病因。自此，人类对流感病毒进行了大量的综合性研究，但流感的预防和控制从始至今是困扰人类的一个难题。甲型流感病毒广泛存在禽类和哺乳动物中, 也是目前致人类和各种动物流感的主型，在人类和动物间流行时可导致高发病率和高死亡率[1]。流感病毒的分子结构和宿主界限有利于流感病毒的复发和疾病的流行，其表面的糖蛋白的高度变异更是导致疫苗免疫效果下降的主要原因[2]。核酸疫苗作为控制流感的新兴技术越来越受到重视，由于其能够同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，易于操作，有效，目前已成为疫苗研究的热点[3]。
自甲型流感病毒发现以来，在检测的毒株中，M2蛋白的基因序列同源性可达90%，未存在明显变异，尤其是N端的10个氨基酸在人流感病毒和禽流感病毒几乎完全相同[4]，这引起了研究人员的极大关注，并进一步研究M2蛋白能否产生交叉免疫引起广泛的抗甲型流感病毒的作用。因此，M2蛋白被认为是流感病毒疫苗可刺激机体产生交叉保护效果的极具潜能保护性抗原。本课题针对流感病毒M2基因进行克隆并构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/M2。利用Polyfect转染HEK293细胞，借助免疫荧光技术鉴定其在体外细胞的表达，以便为今后进一步深入开展核酸疫苗的免疫效果、免疫机制和携带不同基因核酸疫苗的联合应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 载体和细胞株
真核表达载体pcDNA3.1(+)为Invitrogen公司产品。感受态大肠埃希菌JM109为Takara公司产品。HEK293细胞株来自美国典藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。
1.2 材料和试剂
人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)由疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所国家流感中心提供。SPF鸡胚由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。DNA marker(dl2000)为Promega公司产品。Trizol试剂为Invitrogen公司产品。Premix Taq为Takara公司产品。限制性内切酶XhoⅠ和Hind Ⅲ、T4DNA连接酶为New England公司产品。ReverAidTm H Minus First Strand cDNA Sythesis Kit购于Fermentas公司。胶回收使用上海华舜生物公司试剂盒Gel Extraction Min Kit。质粒提取使用Omega 公司的E.Z.N.A Plasmid Mininprep KitⅠ。DMEM培养基为Gibco公司产品。转染试剂盒Polyfect Transfection Reagent为Qiagen公司产品。新生小牛血清购自中美合资兰州民海生物工程有限公司。FITC标记兔抗山羊IgG、封闭用羊血清原液均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。兔抗A/PR/8/34(H1N1)抗体由本室制备并低温保存。
1.3 流感病毒RNA的提取
取血凝效价为1∶2 560的病毒鸡胚尿囊液200 μl，加入Trizol试剂200 μl，混匀。加入氯仿100 μl，4 ℃，12 000 r/min，离心15 min。取上清，加入150 μl异丙醇，4 ℃，12 000 r/min，离心15 min。弃上清，加500 μl 75%乙醇，8 000 r/min，离心10 min。弃上清，加入50 μl 1‰DEPC处理水。
1.4 引物设计及RT-PCR
根据已报道的流感病毒M基因序列A/PR/8/34（Genbank/NCBI ISDN13425）。由Primer Premier 5软件设计引物（本引物由上海博亚生物技术公司合成）。上游引物Primer1（5' CCGAAGCTTTCTGGAAAATGATCTTCTTG 3'）设有Hind Ⅲ 酶切位点，下游引物Primer2 （5' GTCTCGAGTTACTCTAGCTCTATGCTGAC 3'）设有XhoⅠ酶切位点。根据Fermentas公司试剂盒说明，用特异引物Primer2 反转录获得M2 cDNA后进行PCR扩增。反应条件为预变性94 ℃4 min, 94℃30 s，48 ℃35 s，72 ℃35 s，30个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收。
1.5 pcDNA3.1(+)/M2真核表达载体构建及鉴定
PCR回收产物与载体pcDNA3.1(+)质粒经限制性内切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ双酶切后，回收300 bp目的基因片段和5.4 kb载体片段。将目的基因片段与载体片段按1∶3~1∶5摩尔比例加入到连接反应体系中，在T4连接酶作用下16 ℃过夜连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109。用Amp抗性筛选阳性克隆，提取质粒DNA。用Hind Ⅲ、XhoⅠ双酶切、PCR方法及ABI PRISMTM377XL DNA sequence测序仪测序鉴定所筛选的阳性克隆。将所克隆片段的序列在NCBI/GenBank数据库进行Blast 比对和分析。
1.6 转染HEK293细胞
HEK293细胞常规培养于含10%小牛血清的DMEM中，于转染前一天收集细胞并接种于铺有盖玻片的六孔板中，细胞浓度约为6×10５个/孔。在37 ℃，5%CO2条件下培养24 h，使每孔中细胞汇合达60%左右。按Polyfect Transfection Reagent说明书进行转染，重组质粒各设3个复孔，每孔操作如下：将重组质粒1 μg溶于100 μl不含血清及抗生素的DMEM培养基中，然后加入20 μl Polyfect，旋涡混匀。20 ℃~25 ℃静置5~10 min后，加入0.6 ml含血清及抗生素DMEM培养基。吸出六孔板孔中的培养液，加入1.5 ml含血清及抗生素新鲜DMEM培养基，然后迅速加入转染复合物，轻轻摇匀，37 ℃，5%CO2培养箱培养48 h后检测目的基因的表达。转染同时另设两组对照：一组为空载体转染对照，一组为空白对照。
1.7 免疫荧光法鉴定瞬时表达
将上述转染细胞培养48 h后，用PBS冲洗3次，每次2 min。4%多聚甲醛固定15 min， PBS冲洗3次，每次2 min。室温下用封闭血清封闭30 min，兔抗A/PR/8/34(H1N1) 做1∶200～1∶800稀释，每一稀释度滴加2孔，每孔20 μl，4 ℃过夜。第二天用PBS冲洗3次，每次2 min，滴加1∶100稀释的荧光标记羊抗兔IgG抗体20 μl，37 ℃孵育30 min。以上操作皆在六孔板中进行。将六孔板内细胞爬片取出，置于装有PBS的平皿中彻底冲洗3次，每次2 min，以50%甘油封片，置荧光显微镜下检测。
2 结果
2.1 RT-PCR结果
通过RT-PCR得到一条大小约300bp的单一特异性条带，与预期的M2片段大小相符。见图1 。
图1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳（略）
1: DNA marker 2:RT-PCR产物
Fig1 RT-PCR amplification of M2
1: DNA marker; 2:RT-PCR products
2.2 pcDNA3.1(+)/M2真核表达重组质粒PCR及酶切鉴定
挑选阳性克隆，扩增并提取DNA。经HindⅢ/ XhoⅠ双酶切鉴定，琼脂糖电泳后显现大小约300bp的基因片段，见图2。阳性克隆进一步进行PCR鉴定，经琼脂糖电泳后出现目的基因片段，由此说明插入片段的存在。
图2 双酶切鉴定重组质粒（略）
1,2,3:酶切鉴定阳性克隆(Hind Ⅲ+ XhoⅠ); 4:DNA marker;5,6,7:酶切鉴定阴性克隆(HindⅢ+ XhoⅠ)
Fig 2 Identification of recombinant plasmids digested by restriction endonucleases，1~3:positive clone（HindⅢ+ XhoⅠ）;4: marker; 5~7: negative clone（HindⅢ+ XhoⅠ）
2.3 重组质粒序列测定
重组质粒送交北京三博远志生物技术公司测序，见图3。目的序列测序结果提交GenBank进行Blast比对，结果显示与流感病毒A/PR/8/34的M2基因同源性为97%，仍然存在氨基酸的变异（第26位T－V，第38位T－I, 第60位G-R, 第69位K-T），N端的24个氨基酸完全一样，与报道[6]结果相符合，证实了所克隆的片段正确。
2.4 荧光免疫化学法鉴定转染结果
转染细胞培养48 h后，经免疫荧光染色后在倒置荧光显微镜下可观察到重组质粒pcDNA3.1(+)/M2部分细胞有较强的绿色荧光，而两对照组均未见有绿色荧光出现，见图4。
3 讨论
流感病毒基因组第7节段编码病毒的M蛋白，包括M1和M2。M2蛋白是除HA，NA外的第三种跨膜蛋白，含有97个氨基酸，不含糖基，具有高度保守性，它以四聚体的形式存在于类脂膜上[5]。M2蛋白在甲型流感病毒颗粒包膜上呈低密度表达（平均每个病毒颗粒上有10个M2四聚体，400个血凝素三聚体，100个神经氨酸酶四聚体），但在感染细胞的胞膜上却是高密度表达（与HA有相似的密度）。M2四聚体具有质子泵转运功能；能够协助病毒与宿主细胞膜融合再释放RNP复合体；同时还可降低将病毒跨膜蛋白由粗面内质网转运至胞膜的转运小泡的pH值，从而阻止HA前体因酸性pH诱导引起的变构。但是M2蛋白所形成的离子通道可被金刚烷胺阻断。Castrucci利用金刚烷胺抗性为选择标准建立了甲型流感病毒M基因的反向遗传系统，并利用该反向遗传系统证实M2羧基末端缺失谷氨酸的甲型流感病毒可产生金刚烷胺抗性，但当病毒羧基末端缺失5~10个氨基酸残基则在有金刚烷胺存在的条件下不能继续复制繁殖。由此说明M2的羧基端在病毒的复制中起重要作用[6]。
M2蛋白的高度保守性和具有交叉保护能力特性使之成为新型的通用流感疫苗的突破口。一些研究小组对含M基因（M1和M2）的质粒进行免疫效果的研究：Donnelly[7]等的研究证实了用针对流感病毒保守性的内部蛋白（NP和M1）的DNA疫苗与HA肌肉注射共同免疫小鼠，小鼠能抵抗多株流感病毒的攻击，比亚单位疫苗和灭活疫苗效果更好。 Okauda[8]分别用表达完整的M2蛋白和表达缺失跨膜区的M2蛋白（降低毒性和增加可溶性）的质粒免疫动物，实验显示这几种质粒都诱导机体产生了保护作用，不仅抑制了病毒生长繁殖，而且降低了动物的死亡率。Watanabe[9]等进一步通过改造M2蛋白的离子通道活性来获得减毒活疫苗。Liu[10]等则发现针对M2蛋白最保守的胞外区（M2e）表位制备的单克隆抗体能产生良好的免疫保护作用。
本实验成功的构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/M2，并用脂质体介导法将其转染到HEK293细胞中获得了表达，这为今后开展基因工程疫苗和核酸疫苗以及通用疫苗的进一步研究打下了基础。
（文中图3~4见封三）（略）
[参 考 文 献]
[1] Potter CW. A history of influenza[J].J Appl Microbiol,2001,91(4):572-579.
[2] Cox NJ,Subbarao K.Global epidemiology of influenza:past and present[J].Annu Rev Med,2000,51:407-421.
[3] Robinson HL. Nucleic acid vaccines: an overview[J].Vaccine,1997,15(8):785-787.
[4] Ito T,Gorman OT,Kawaoka Y, et al.Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2 proteins[J].J Virol,1991,65(10):5 491-5 498.
[5] Sugrue RJ,Hay AJ.Structural characteristics of the M2 protein of influenza A viruses: evidence that it forms a tetrameric channel[J].Virology,1991,180(2):617-624.
[6] Donnelly JJ, Friedman A, Martinez D,et al.Preclinical efficacy of a prototype DNA vaccine: enhanced protection against antigenic drift in influenza virus[J].Nat Med,1995,1(6):583-587.
[7] Castrucci MR, Kawaoka Y. Reverse genetics system for generation of an influenza A virus mutant containing a deletion of the carboxyl-terminal residue of M2 protein[J].J Virol,1995,69(5):2 725-2 728.
[8] Okuda K, Ihata A, Watabe S,et al.Protective immunity against influenza A virus induced by immunization with DNA plasmid containing influenza M gene[J].Vaccine,2001,19(27):3 681-3 691.
[9] Watanabe T, Watanabe S, Kida H,et al. Influenza A virus with defective M2 ion channel activity as a live vaccine[J].Virology,2002,299(2):266-270.
[10] Liu W,Zou P,Chen YH.Monoclonal antibodies recognizing EVETPIRN epitope of influenza A virus M2 protein could protect mice from lethal influenza A virus challenge[J].Immunol Lett,2004,93(2-3):131-136.
