二苯乙烯苷对D-半乳糖致拟痴呆小鼠学习记忆和海马APP、Aβ表达的影响

            作者：黄忠仕，谢海源，农嵩，李韬，张树球

【摘要】  　　目的 观察二苯乙烯苷（TSG）对D-半乳糖致拟痴呆小鼠学习记忆能力及海马β淀粉样蛋白前体(APP)、β淀粉样蛋白(Aβ)表达的影响。方法 连续给昆明种小鼠灌胃TSG 50天，同时每天颈部皮下注射D-半乳糖建立痴呆小鼠模型，以Morris水迷宫为学习记忆评价指标，并采用免疫组化及图像分析测定各组小鼠海马组织APP、Aβ平均光密度和阳性细胞数。结果 在隐蔽平台试验中拟痴呆小鼠表现出明显的学习记忆障碍，逃避潜伏期显著延长（P<0.05），TSG各剂量组逃避潜伏期较模型组显著缩短（P<0.05）；探索试验中TSG各剂量组原平台象限的停留时间和穿越原平台次数明显多于模型组。与模型组比较，TSG各剂量组能降低拟痴呆小鼠脑内APP、Aβ平均光密度值和阳性细胞数(P<0.05)。以上效应均呈现一定的量效关系。结论 TSG各剂量能明显地改善拟痴呆小鼠的学习记忆能力，能减少或抑制APP、Aβ的过度产生，保护神经元免受Aβ的神经毒性。

【关键词】  二苯乙烯苷 痴呆 学习记忆能力 淀粉样β蛋白前体 淀粉样β蛋白 小鼠 动物 实验

　　Abstract:  Objective  To study the effects of 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glylcoside (TSG) on learning and memory abilities and expressions of β-amyloid precursor protein (APP) and β-amyloid (Aβ) in hippocampus of mice with dementia induced by D-galactose.  Methods  After the mice were treated with intragastric  administration with TSG for 50 days continually, the mice were treated subcutaneous injection with D-galactose at the same time to establish the dementia model, then the Morris water maze test was performed to survey the learning and memory abilities, and the immunohistochemical analysis and computerized image presentation analysis system were used to determine the APP and Aβ average optical density and their immunoreactive neurons in hippocampus.  Results  The mice with dementia had learning and memory disorders during hidden platform test, and the escape latency were significantly longer than that of TSG-treated groups (P<0.05).  TSG-treated groups could significantly prolong the staying time and the frequency of crossing original platform quadrant in spatial probe test (P<0.05). Compared with model group, TSG-treated groups could decrease significantly the APP and Aβ average optical density and their immunoreactive neurons in hippocampus of mice with dementia via immunohistochemical analysis (P<0.05). All the data showed a dose-response relationship to some degree.  Conclusion  TSG can improve the learning and memory abilities in mice with dementia and reduce or inhibit the over-expression of APP and Aβ in hippocampus of mice with dementia, so as to protect the neurons from the neurotoxicity of  Aβ.
   
　　Key words:  2,3,5,4'- tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glylcoside; dementia; learning and memory abilities; β-amyloid precursor protein; β-amyloid; mice; animals, experiments

　　阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD）是一多发在老年，以近期记忆障碍为主要临床症状，老年斑（SP）、神经元纤维缠结（NFT）和神经元丢失为主要病理改变的进行性神经变性疾病。目前AD的发病机制尚未完全清楚，亦无良好的防治措施，因此研究AD的发病机制和开发新的药物成为当前研究热点之一。二苯乙烯苷（2,3,5,4'-四羟基-二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷，TSG）是何首乌中的主要水溶性成分，近年来发现其具有抗衰老作用、神经保护作用、降血脂及抗动脉粥样硬化作用等［1,2］。其作用机制是多靶点、多环节、多途径的，因此对老年性痴呆等神经退行性病变的防治具有很好的应用价值，可开发研制为治疗老年性痴呆的新药物。本实验以D-半乳糖建立拟痴呆小鼠模型，观察TSG对拟痴呆小鼠学习记忆及海马组织β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein, APP）、β淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）表达的影响，现报道如下：

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  动物 

　　昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重20±2g，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXKG桂2003-0003，实验动物使用许可证：SYKG桂2003-0005）。

　　1.1.2  主要试剂 

　　D-半乳糖（Sigma公司提供）；石杉碱甲（豫中制药厂生产，批号：H10940156）；一抗：β-Amyloid precursor protein，β-Amyloid兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德公司生产，批号：BA0580）；二抗：即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒；DAB显色试剂盒（福建迈新公司生产）。

　　1.1.3  主要仪器设备 

　　Morris水迷宫（院药研所制）；湖北孝感亚鹏TS-12U生物组织自动脱水机；武汉俊杰JB-L5生物组织石蜡包埋机；Shandon切片机；奥林巴斯光学显微镜；重庆天海彩色病理图像分析系统；恒温培养箱。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物分组与给药方式 

　　将昆明种小鼠60只随机分为6组（每组10只）：①正常对照组；②模型组；③石杉碱甲组；④TSG低剂量组；⑤TSG中剂量组；⑥TSG高剂量组。各组均按0.2ml/10g体重给药，①②组每天灌0.9%生理盐水；③组灌石杉碱甲0.02mg/kg体重；④组灌TSG 0.033g/kg体重；⑤组灌TSG 0.1g/kg体重；⑥组灌TSG 0.3g/kg体重。②～⑥组同时颈部皮下按120mg/kg体重注射D-半乳糖（配成0.6%浓度），每天一次，连续50天。

　　1.2.2  隐蔽平台试验 

　　从第46天起，进行Morris水迷宫试验，连续5天。Morris水迷宫为一不锈钢的圆形水池，内壁黑色，直径100cm，高50cm，水温控制在（22±1）℃。水池等分为4个象限，任选其中1个象限，正中放置1个安全平台。平台为圆形，直径10cm，没于水下1cm。水池放在一间小屋的中央，室内的门、窗、摄像头等构成视觉暗示。迷宫上方安有摄像机，并和机连接，自动录入小鼠游泳轨迹并进行分析。历时5天，每天上下午各1次，入池位置为平台所邻2个象限的池壁中点。将小鼠面向池壁分别从入水点放入水中，记录其在100s内寻找到平台的时间（逃避潜伏期，escape latency）。如果小鼠在100s未找到平台，则由实验者用手牵引其至平台上，停留10s，逃避潜伏期记成100s。每天以两次潜伏期算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。

　　1.2.3  探索试验 

　　撤除平台，任选1个入水点将小鼠放入水中，使小鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台，记录其100s的游泳轨迹、原平台象限游泳的时间和穿越原平台的次数。

　　1.2.4  免疫组化测定APP和Aβ 

　　治疗结束后，处死小鼠，冰上迅速取出小鼠脑组织，放置-80℃冰箱保存。切片前从-80℃取出，依次放入-20℃、4℃冰箱各半小时，再用10%福尔马林固定。依次脱水，浸蜡，包埋，连续切片。采用MaxvisionTM快捷免疫组化染色法测定，切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；APP，Aβ在pH 6.0±0.1柠檬酸缓冲液于压力锅中加热至沸腾修复抗原1.5min；每张切片加50μl 3%过氧化氢，室温下孵育10min以阻断内源性过氧化物酶的活性；再加50μl的APP或Aβ兔抗大鼠多克隆抗体（均按1∶100稀释），在4℃温度下孵育过夜；随后加50μl即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒的二抗，室温下孵育15min；DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤终止反应，苏木素轻度复染30s，自来水冲洗，返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。经DAB显色，Aβ、APP阳性细胞为棕黄色。用PBS代替一抗作为阴性对照。在APP、Aβ免疫组化染色切片的海马区各取3个视野（×400），应用图像分析系统测量每个视野内APP、Aβ平均光密度和阳性细胞数。

　　1.2.5  统计方法 

　　所有检测结果以±s表示。用SPSS10.0统计软件分析，两组间均数比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  隐蔽平台试验结果 

　　见表1。由表1可以看出，隐蔽平台试验从第1天起，模型组的逃避潜伏期即明显短于正常对照组（P<0.05或P<0.01），说明长期注射D-半乳糖后，小鼠的学习记忆明显下降。石杉碱甲组和TSG组从第3天起，逃避潜伏期明显短于模型组（P<0.05或P<0.01），说明用药后能改善拟痴呆小鼠的学习记忆能力。TSG组与阳性药石杉碱甲组比较差异无显著性(P>0.05)。表1  TSG对D-半乳糖致拟痴呆小鼠隐蔽平台试验逃避潜伏期的影响（略）

　　2.2  探索试验结果 

　　见表2。正常对照组、石杉碱甲组和TSG各组轨迹大部分位于原平台象限，其次较多地在原平台象限相邻的左右两侧象限寻找，但模型组基本围绕池壁游泳，其运动轨迹呈随机分布于各象限之中。由表2可以看出，正常对照组、石杉碱甲组和TSG各组的停留原平台象限时间和穿越原平台次数均明显多于模型组，差异具有显著性（P<0.05或P<0.01），说明用药后各组拟痴呆老鼠的记忆能力比模型组老鼠强，提示TSG能增强痴呆模型鼠的记忆能力。表2  TSG对D-半乳糖致拟痴呆小鼠探索试验的影响(略)

　　2.3  APP和Aβ免疫阳性细胞的形态学观察 

　　见图1～图2。APP和Aβ免疫阳性神经元呈锥形、不规则形等。阳性反应物呈棕黄色，定位于细胞膜及胞浆，细胞核呈阴性。另外在脑血管壁上也可见APP和Aβ的沉积。正常对照组小鼠海马区有少量APP和Aβ神经元表达，阳性反应物染色较浅；拟痴呆小鼠海马APP和Aβ免疫阳性神经元广泛表达于神经细胞胞浆，染色较深；石杉碱甲组和TSG各剂量组海马区APP和Aβ免疫阳性神经元细胞数较模型组明显降低。

　　2.4  免疫组织化学染色结果 

　　见表3。与正常对照组相比，模型组小鼠海马区APP和Aβ平均光密度值和阳性神经元细胞数显著升高，差异具有显著性（P<0.05或P<0.01）；与模型组相比，石杉碱甲组和TSG各剂量组平均光密度和阳性细胞数明显降低，其差异具有显著性（P<0.05或P<0.01）。提示TSG能减少Aβ和APP平均光密度值和免疫阳性神经元细胞数。表3  TSG对各组小鼠海马Aβ和APP表达的平均光密度和阳性细胞数的影响  (略)

　　3  讨论

　　D-半乳糖所致亚急性衰老模型是较好的老化伴记忆衰退模型，该模型表现出与人类衰老相似的生化改变，免疫功能低下，基因表达与调控异常，细胞生长繁殖能力下降及细胞退行性变，它可诱导脑老化，出现与AD的外在表现和脑内海马结构相一致的变化，因此可作为部分模拟AD的动物模型［3～5］。本实验结果显示，长期注射D-半乳糖可致小鼠学习记忆能力降低，海马组织APP和Aβ表达增高，与上述报道一致。
   
　　小鼠水迷宫实验是一种主要依赖海马的空间性作业，检测的是小鼠空间学习记忆能力，通常被认为是一种工作记忆，相当于人类的近期记忆。本实验采用Morris水迷宫对痴呆动物行为学进行测定。隐蔽平台试验中的逃避潜伏期反映了动物空间记忆的获得情况，即学习能力；探索试验是Morris水迷宫中较为敏感而精确的测试方法，测量动物的记忆保持能力［6～8］；本实验结果显示D-半乳糖致拟痴呆小鼠的学习记忆能力明显低于正常对照组的小鼠，具体表现为：逃避潜伏期明显延长，原平台象限的停留时间缩短，再学习能力下降，分析判断能力低下。隐蔽平台试验中，TSG组小鼠的逃避潜伏期明显缩短，提示经TSG后拟痴呆小鼠的学习记忆能力得以明显改善。探索试验结果显示，正常对照组、阳性药对照组和TSG各组的停留原平台象限时间和穿越原平台次数均明显多于模型组，差异具有显著性（P<0.05或P<0.01），说明经TSG干预后各组小鼠的记忆保持能力得到增强。TSG各组和阳性药石彬碱甲组之间差异无显著性，说明TSG改善痴呆小鼠学习记忆能力与目前老年性痴呆治疗常用药物胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲相当。

　　Aβ是AD主要病理改变老年斑的核心成分，研究证明Aβ的沉积是AD病理的始发因素和中心环节［9,10］。Aβ来源于APP［11］。主要是APP经过β分泌酶酶和γ分泌酶切发生裂解产生Aβ［12］。Aβ具有神经元毒性作用，可以引起神经元的退变、凋亡［13］。一般认为，Aβ神经毒性作用是聚集依赖的方式或聚集相关毒性，即可溶性Aβ聚集成不溶性Aβ纤丝才具有更强毒性。Aβ肽链越长，越容易聚集沉积。通过在细胞外的积聚，促进神经细胞骨架的改变，从而导致神经损伤。Aβ除对细胞具有直接毒性作用外，还可增强或放大各种伤害性刺激如低糖、兴奋性毒性、自由基等细胞损伤效应［14］。本实验对TSG干预拟痴呆小鼠海马组织APP、Aβ的表达进行了研究，结果显示：与模型组比较，TSG组APP、Aβ表达水平明显降低，差异具有显著性，并且差异有显著性的蛋白表达呈现出一定的量效关系。而与阳性药石杉碱甲组的APP、Aβ比较，差异均无显著性，说明其疗效与胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲相当。
  
　　以上结果显示，TSG能明显地改善拟痴呆小鼠的学习记忆能力，能减少或抑制APP、Aβ的过度产生，保护神经元免受Aβ的神经毒性，具有较好的抗痴呆作用。

【文献】
  　　［1］王春英.何首乌中有效成分二苯乙烯苷的研究进展［J］.河北医科大学学报，2008，29（1）：157-160.

　　［2］贾新,陈建宗.二苯乙烯苷神经保护作用及其机制的研究进展［J］.国际中医中药杂志，2007，29（6）：347-348.

　　［3］Deng HB, Cui DP, Jiang JM, et al. Inhibiting effects of Achyranthes bidentata polysaccharide Lycium barbarum polysaccharide on nonenzyme glycation in D-galactose induced mouse aging model［J］. Biomed Environ Sci, 2003,16(3):267-275.

　　［4］Pratt RC, Stack TD. Intramolecular charge transfer and biomimetic reaction kinetics in galactose oxidase model complexes［J］. J Am Chem Soc,2003,125(29):8716-8717.

　　［5］Song X, Bao M, Li D, et al. Adanced glycation in D-galactose induced mouse aging model ［J］. Mech Ageing Dev, 1999, 108(3): 239-251.

　　［6］Gandhic CC, Kellyl RM, Wiley RG, et al. Impaired acquisition of a Morris water maze task following selective destruction of cerebellar purkinje cells with OX7-saporin ［J］. Behav Brain Res,2000,109(1):37-47.

　　［7］Pouzet B, Zhang WN, Feldon J, et al. Hippocampal lesioned rats are able to learn a spatial position using non-spatial strategies ［J］. Behav Brain Res,2002,133(2):279-291.

　　［8］Kucuktay V, Balkan S, Yaras N, et al. The effect of pergolide on cognitive performance of young and middle-aged rats ［J］. Int J Neurosci,2002,112(9):1027-1036.

　　［9］覃仁安,罗佳波,黄竹英,等.复方丹参片对阿尔茨海默病大鼠学习记忆障碍和脑组织β-AP含量的影响［J］.中华中医药杂志,2005,20(6):377-378.

　　［10］Kumar S, Nigel HG, Debomoy KL. Advances in the cellular and molecular biology of the beta-amyloid protein in Alzheimer's disease ［J］. Neuro Molecular Medicine,2002,1(1): 1-31.

　　［11］Gevorkian G, Petrushina I, Manoutcharian K, et al. Mimotopes of conformational epitopes in fibrillar β-amyloid ［J］. Journal of Neuroimmunology,2004,156(1-2):10-20.

　　［12］陈烈冉,张博爱,高林,等.大鼠前脑不全缺血再灌注后β-淀粉样蛋白的表达及意义［J］.实用神经疾病杂志,2006,9(2):50-51.

　　［13］Cataldo AM, Petanceska S, Terio NB. Aβ localization in abnormal endosomes: association with earliest Aβ elevations in AD and down syndrome ［J］. Neurobiology of Aging,2004,25(10):1263.

　　［14］王乃东,谭兰.β淀粉样蛋白及其前体蛋白与缺血性脑损伤［J］.国外医学:脑血管疾病分册,2000,8(3):142.