内皮素转化酶抑制剂治疗脑血管痉挛的免疫组化研究

            作者：赵振伟,高国栋,赵继培,秦怀洲,邓剑平,陈玲,卫德来

【关键词】  血管痉挛

　　【Abstract】AIM：  To investigate the function of endothelin1 (ET1) in the cerebral vasospasm (CVS) following subarachnoid hemorrhage (SAH), the effects of ［DVal22］ big ET1 (1638), an endothelin converting enzyme inhibitor, on the expression of ET1 in the wall of basilar artery and the differences of these effects by different ways and timing of injection. METHODS:  CVS models were developed by injecting arterial blood twice through the citerna magna 48 hours apart. Thirtysix rabbits were equally assigned to six groups: control group, SAH group, prevention group with citerna magna injection, prevention group with intravenous injection, treatment group with citerna magna injection, and treatment group with intravenous injection group. All animals were killed for perfusionfixation on day 7. The basilar arteries and some brain tissue were removed for immunohistochemical studies. RESULTS:  The immunohistochemical study on SAH day 7 found that in control group, the basilar arteries showed scattered irregular positive staining, and in SAH group, severe positive staining was found in EC, SMC and adventitia, especially in EC. In the other four groups, EC, SMC and adventitia showed slightly immunohistochemical staining. But there was no positive staining in brain cells adjacent to basilar artery. CONCLUSION:  This study demonstrates that Big ET1(1638) markedly inhibits immunological expression of ET1 in basilar arteries, which not only effectively prevents CVS, but also reverses CVS via the cisterna magna or intravenously. Our study indirectly proves that ET1 is a major pathogenic factor of CVS.

　　【Keywords】  subarachnoid hemorrhage;   vasospasm, intracranial; endothelinconverting enzyme inhibitor; endothelin1; immunohistochemistry

　　【摘要】目的： 应用免疫组化方法探讨ET1在蛛网膜下腔出血（SAH）引起的脑血管痉挛(CVS)中的作用，以及［DVal22］大ET1(1638)对基底动脉壁 ET1表达的影响和不同用药方式和时机的作用是否相同.方法： 采用枕大池双注血法制备36只兔SAH后CVS模型，随机分成生理盐水对照组、SAH组、脑池给药预防组、静脉给药预防组、脑池给药组和静脉给药治疗组.全部实验动物于首次注血后7 d进行灌注固定，留取基底动脉和脑组织标本，进行免疫组织化学染色，观察ET1的免疫表达.结果： ET1免疫阳性标记颗粒在生理盐水对照组散在不规则表达，而在SAH组血管壁各层都有重度表达.用药预防和治疗组免疫染色强度基本一致，血管壁各层的ET1免疫反应强度介入SAH和对照组之间.结论： ［DVal22］大ET1（1638）可明显抑制基底动脉壁ET1的免疫表达，无论脑池还是静脉给药均能够达到有效地预防和治疗SAH后CVS.

　　【关键词】 蛛网膜下腔出血；血管痉挛，颅内；内皮素转化酶抑制剂；内皮缩血管肽1；免疫组织化学

　　0引言

　　蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛（CVS）所导致的缺血性损害是颅内破裂动脉瘤死亡率和致残率居高不下的主要原因［1］，但脑血管痉挛的确切发病机制尚不十分清楚.大量的实验研究表明含有21个氨基酸、具有明显剂量依赖，可持久收缩血管的多肽――内皮素（ET1）是SAH后CVS的发生过程中的重要致病因子.SAH后血液溶解产物通过各种途径促进了ET1的释放和生物合成，同时破坏和抑制一氧化氮（NO）的生物学作用，使维持脑血管正常舒张和收缩的平衡遭到了破坏，导致CVS发生.实验研究证实内皮素转化酶ECE抑制剂［DVal22］大ET1(16~38)可有效预防SAH后CVS的发生［2］，但其是否可以治疗或逆转SAH后CVS，不同途径给药是否可以同样发挥预防和治疗SAH后CVS，对基底动脉内膜和平滑肌中ET1的免疫表达有何影响均未见报道.本研究的目的是探讨［DVal22］大ET1(16~38)对基底动脉壁 ET1的表达的影响以及不同用药方式和时机的抑制作用是否相同.

　　1材料和方法

　　11材料

　　二级新西兰白兔36只(第四军医大学实验动物中心)，雌雄不限，体质量26～32 kg，平均28 kg，2×10-5mol/L内皮素转化酶（ECE）抑制剂（DVal22）大ET1（1638）生理盐水溶液（Peptides Co. 美国），1∶300兔二抗PBS溶液（博士德，武汉），1∶200抗内皮素抗体PBS溶液（博士德，武汉），40 g/L的多聚甲醛固定液，1∶500 ABC复合物，DAB硫酸镍胺显色液.

　　12方法

　　121动物模型白兔枕部剃毛，消毒后于枕部中线作一直切口，长25 cm，锐性分离直达寰枕筋膜，充分显露寰枕部，用18G套管针与躯体成角约30°穿刺枕大池，退出针芯，此时可见清亮CSF流出.取自体股动脉的非抗凝血25 mL，缓慢注入枕大池内.退出套管针，局部压迫后，缝合切口，取侧卧头低30°位放置30 min，使血液集积在脑基底池.首次注血后48 h，由兔耳中央动脉取血25 mL，按上述方法，再次注入枕大池内.

　　122分组将36只动物模型随机分为6组： ① 对照组，枕大池内注射生理盐水25 mL，48 h后再次注射25 mL生理盐水.② SAH组，注射自体动脉血25 mL，48 h后再次注射25 mL自体动脉血.③ 脑池给药预防组，枕大池内注射自体动脉血25 mL.随后注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38）生理盐水，48 h后先后注射25 mL自体动脉血和05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理盐水.④ 静脉给药预防组，枕大池内注射自体动脉血25 mL.同时静脉内注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理盐水.48 h后枕大池再次注射25 mL自体动脉血，静脉内注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理盐水.⑤ 脑池给药治疗组，枕大池内注射自体动脉血25 mL.24 h后枕大池内注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理盐水.首次注血48 h后枕大池内再次注射25 mL自体动脉血，24 h后枕大池注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理盐水.⑥ 静脉给药治疗组，枕大池内注血25 mL.24 h后静脉内注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理盐水.首次注血48 h后枕大池内再次注射25 mL自体动脉血，24 h后静脉内注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理盐水.

　　123灌注固定所有白兔饲养7 d后，以10 g/L的戊巴比妥钠麻醉（30 mg/kg），打开胸腔，拨开心包膜，暴露心脏，剪开右心房放出血液，再剪开左心室将灌注头插入主动脉用动脉夹固定，先输入生理盐水将血管内的血冲洗干净，再注入40 g/L的多聚甲醛固定液2000 mL灌流固定.

　　124免疫组织化学标本将基底动脉标本放入200 g/L蔗糖液中4℃下浸泡24 h，直至组织完全沉底.将标本在恒冷箱切片机制作成14 μm切片，应用ABC法进行免疫组织化学染色，在光镜下进行观察.

　　2结果

　　实验动物在摄食、饮水、睡眠及体质量等指标与对照组动物未见有何差别，枕大池注血及［DVal22］大ET1(1638)后未发现神经功能障碍.灌注取标本，肉眼下可见凝血块主要聚积在脑基底池和基底动脉周围.

　　对照组标本可见基底动脉内膜细胞上可见散在不规则ET1免疫阳性标记颗粒，平滑肌内则未见免疫阳性标记颗粒（Fig 1A）.而珠网膜下腔出血组动物的基底动脉的内皮细胞、平滑肌和外膜上ET1重度染色，以内皮细胞最为突出（Fig 1B）.而其他4组，脑池给药预防组、静脉给药预防组 、脑池给药治疗组和静脉给药治疗组免疫染色强度基本一致，血管内皮细胞、平滑肌和外膜ET1免疫反应明显变淡，仍可见免疫阳性标记颗粒，血管壁各层的ET1免疫反应强度介入珠网膜下腔出血组和对照组之间（Fig 1C）.邻近基底动脉的脑组织（脑干）在各组中未见明显的免疫染色.

　　3讨论

　　ET1是ET家族中最具活性的多肽，在活体和离体实验中均可引起一种剂量依赖性，持久的缩血管反应［3］.在SAH后应激反应可使全身血管内皮合成和分泌增加，引起血浆中ET含量升高，此情形下脑血管内皮合成和分泌的ET有可能穿过基底膜作用于平滑肌， 引起脑血管痉挛［4］. Ohkuma等［5］应用免疫组化分析前ET原反义寡DNA治疗犬SAH后CVS时发现，空白对照组血管EC，中层SMC和外膜ET1产物的表达弱而不规则，而SAH后 2、4和7 d脑血管EC，SM和外膜均可见到不同程度的免疫反应性ET1产物.Shigeno等［6］采用免疫组化染色发现正常基底动脉仅在内皮上可见散在的ET染色，而SAH后3 d内层全层可见过度的免疫表达.放射菌素D（非特异性ECE抑制剂）治疗组，ET的免疫反应被抑制，SAH组表达明显.以上研究说明ET1与脑血管痉挛有明确的关系.

　　本研究通过免疫组化法证实对照组内皮细胞内可见散在的，不规则的ET免疫染色，SAH后7 d EC 、SM和外膜重度染色，以EC最为突出.［DVal22］大ET1(16~38)预防组，治疗组及不同用药方法组，ET染色淡，介于对照组和SAH组之间，而且不同途径给予的治疗组和预防组之间没有明显的差别.此结果表明： SAH后血液溶解产物可能刺激了EC、SM和外膜内源性ET的表达,破坏了ET1和NO之间的平衡，导致CVS发生；证实内源性ET1在CVS过程发挥了重要作用；［DVal22］大ET1(16~38)有效地阻断了无活性大ET1转化成具有活性的ET1，使ET1表达下降，不仅能够预防脑血管痉挛的发生，同时能够治疗珠网膜下腔出血引起的脑血管痉挛.但是本实验仅对SAH后7 d ET的免疫反应进行了观察，而SAH后不同时间内的表达如何？［DVal22］大ET1(16~38对ET1的免疫反应有何影响？需进一步研究.

　　那么SAH后引起收缩的ET究竟来源何处？有研究证实颅底大血管壁中有ET，存在于内皮及平滑肌上，且SAH后早期ET明显增加.有人发现OxyHb能刺激培养的血管内皮合成ET增加，且主要向基底面分泌［7］，故认为可引起基底膜ET增加，ET穿过基底膜作用于平滑肌细胞.此外SAH后CSF，血管及下丘脑部位ET含量升高，CVS中ET含量变化与下丘脑部位含量变化有良好的相关性［8］；从蛛网膜下腔阻断ET作用，能有效地预防和逆转CVS，说明ET作用血管是从CSF中血管外膜方面，且CSF中ET可能来源于下丘脑［9］.而本实验无论是从珠网膜下腔还是从静脉内给药都能达到良好的效果，我们考虑ET1可能来自血管内皮细胞和下丘脑两个部位. 此设想有待进一步研究.

　　【】

　　［1］ Weir B.Subarachnoid Hemorrhage: Causes and Cures ［M］. New York: Oxford University Press,1988：32-39.

　　［2］ Zimmermann M, Jung C, Raabe A, et al. Inhibition of endothelinconverting enzyme  activity in the rabbit basilar artery［J］.  Neurosurgery, 2001;48: 902-908.

　　［3］ Ando K, Hirata Y, Shichiri M, et al. Presence of  immunoreactive endothelin in human plasma ［J］. FEBS Lett, 1989;245: 164-166.

　　［4］ Koseki C, Imai M, Hirate Y, et al. Autoradiographic localization of ［125 I］endothelin1 binding sites in rat brain［J］. Neurosci RES, 1989;6:581.

　　［5］ Ohkuma H, Parney 1, Megyesi J, et al. Antisense preproendothelinoligoDNA therapy for vasospasm in a canine model of subarachnoid hemorrhage［J］. J Neurosurg, 1999;90:1105-1114.

　　［6］ Matsumura Y, Lkegawa R, Tsukahara Y, et al. Conversion of big endothelin1 to endothelin1 by two types of metalloproteinases derived from porcine aortic endothelial cells［J］. FEBS Lett, 1990;272:166-170.

　　［7］ Yasimoto S, Ishizaki Y, Sasaki T, et al. Effect of carbon dioxide and oxygen on endothelin production by culture porine cerebral endothelial cells［J］. Stroke, 1991;22:378.

　　［8］ Wang XY, Zhu C, Zhang GJ, et al. Changes of endothelin during cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage［J］. Chin Med J, 1995;108(8):586.

　　［9］ Clozel M, Watanabe H. BQ123, a peptidic endothelin ET receptor antagonist, prevents  the early cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage after intracisternal but  not intravenous injection［J］. Life Sci, 1993;52: 825-834.