CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠

【关键词】  乙型

    CpG oligodeoxyribonucleotide with hepatitis B surface antigen (HBsAg) for vaccination in BALB/c and HBVtransgenic mice

　　【Abstract】AIM：  To study the effects of CpG oligodeoxyribonucleotide (ODN) as adjuvant on the immune responses in BALB/c and HBV-transgenic mice with hepatitis B surface antigen (HBsAg). METHODS:  BALB/c and HBV transgenic mice were immunized by multiplesite intramuscular injection with HBsAg and phosphorothioate oligodeoxynucleotides containing two CpG motifs. The HBsAg and antiHBs in serum from immunized mice were detected by ELISA and the number of IFNsecreting T cells was examined by ELISPOT. RESULTS:  In BALB/c mice, the mice immunized with CpG ODN plus HBsAg showed higher specific humoral immune responses to HBsAg than those immunized with HBsAg alone. Compared with the immunization with HBsAg or CpG ODN alone, the immunization with HBsAg plus CpG ODN activated respectively 3 or 9 times more HBs-specific IFNsecreting T cells. In HBV transgenic mice, antiHBs in serum were detected in the mice immunized with HBsAg and CpG ODN while no antiHBs in serum in the mice immunized with HBsAg or CpG ODN alone. There was no significant difference in the level of HBsAg in serum between the three groups after vaccination (P>0.05) but the level declined in all three groups compared with those prevaccination (P<0.05). Compared with the immunization with HBsAg or CpG ODN alone, the immunization with HBsAg plus CpG ODN activated, respectively, 3 or 11 times more HBsspecific IFNsecreting T cells. CONCLUSION:  CpG ODN can act as adjuvant to enhance the humoral and cell immune responses in BALB/c mice immunized with HBsAg. CpG ODN oligodeoxyribonucleotide combined with HBsAg can break the tolerance to this antigen in HBV transgenic mice and may become a potential prophylactic and therapeutic approach.

　　【Keywords】  CpG ODN;  hepatitis B surface antigens (HBsAg);  mice, inbred BALB/C;  mice， transgenic;  immune response

　　【摘要】目的：  探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对HBsAg诱导BALB/c和HBV转基因小鼠产生免疫应答的影响.  方法：  用人工合成CpG ODN与血源HBsAg联合免疫BALB/c和HBV转基因C57BL/6J小鼠，采用ELISA方法观察小鼠血清HBsAg及抗HBs水平，用ELISPOT方法判断CpG ODN对HBsAg免疫小鼠脾T淋巴细胞分泌细胞因子的影响.  结果：  CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠较HBsAg单独注射组同期抗HBs滴度明显提高，尤其在首次免疫后6、8、12 wk，2组比较差异显著（P<005），联合免疫较CpG ODN单独免疫自首次免疫后4 ~16 wk差异显著（P<005）.与HBsAg，CpG ODN 单独免疫比较，联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN γ T细胞分别增加3或9倍；CpG ODN，HBsAg联合免疫可诱导转基因小鼠产生抗HBs，随时间延长，抗体滴度逐渐升高，并能使更多小鼠产生抗体，而单用HBsAg组、CpG ODN组均不能诱导抗HBs的产生，免疫后各组血清HBsAg浓度较免疫前明显下降(P <005)，但组间无明显差别（P>005），与HBsAg，CpG ODN 单独免疫比较，联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN γ T细胞分别增加3或11倍.  结论： CpG ODN作为佐剂可增强HBsAg诱导BALB/c小鼠产生体液及细胞免疫应答，CpG ODN ，HBsAg联合免疫可打破HBV转基因小鼠对HBsAg免疫耐受，可望成为慢性乙型肝炎的有效预防和性疫苗.

　　【关键词】 CpG ODN；肝炎型表面抗原（HBsAg），乙型；小鼠，近交BALB/c； 小鼠，转基因； 免疫应答

　　0引言

　　目前，应用于慢性乙型肝炎治疗且具有持久疗效的药物只有IFNα，持续应答率仅30%左右.因此，急需开发新的治疗措施.含CpG基序的寡脱氧核苷酸（CpG ODN）对天然和获得性免疫系统具有广泛的刺激作用，在动物体内可作为多种外源抗原（包括HBsAg）的Th1型免疫佐剂，达到增强体液免疫及细胞免疫的作用［1,2］，CpG ODN联合HBsAg可望成为慢性乙型肝炎的有效治疗性疫苗.为此，我们将人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸CpG ODN联合HBsAg在BALB/c小鼠和转基因小鼠体内进行了实验研究.

　　1材料和方法

　　11材料

　　BALB/c小鼠56只，HBV转基因成功小鼠56只，均为雌性，6~8周龄，购自北京大学医学部实验动物部，转基因小鼠全称为C57BL/6JTgN（A1b1HBV）44Bri，引种自美国Jackson实验室.所转移的基因包括HBV S，PreS及X基因，转入的HBV基因为Ayw 亚型，血清HBsAg阳性，可稳定垂直传代.全部清洁级小鼠均在北京大学医学部实验动物科学部无菌饲养.HBsAg为北大人民肝病研究所提取血源抗原，溶解状态，不含铝佐剂，终浓度5 g/L；含CpG的ODN（序列1826 5′TCCATGACGTTCCTGACGTT3′［划线部分为小鼠最佳CpG基序］），上海生工生物工程公司合成，全链硫代修饰，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，溶于生理盐水使用.

　　12方法

　　用1 mL的OT注射器（25号针头）行双后肢多点im，HBsAg 10 μg，CpG ODN 50 μg，每半月免疫1次，共3次.两种小鼠实验分组相同. ① HBsAg联合CpG ODN组12只（研究目的组），注射前将二者充分混匀，② HBsAg组12只（阳性对照组），③ CpG ODN组8只（阴性对照组）小鼠.分别于免疫前及首次免疫后2，4，6，8，12，16 wk经鼠尾静脉采血, HBV转基因小鼠分别于免疫前，首次免疫后1，3，6 mo经眶后静脉丛穿刺采血，每次采血03～05 mL，13000 r/min，10 min，收集上清置-20℃冰箱保存备用.另取同品系BALB/c小鼠和转基因小鼠各24只，分组、接种剂量同上，各8只，每半月免疫1次，共2次，末次免疫后2 wk处死小鼠，无菌状态取脾制备脾细胞悬液，用ELISPOT检测小鼠HBsAg特异性分泌IFNγ T细胞数量.血清HBsAg及抗HBs的检测用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测血清HBsAg及抗HBs，试剂盒购自美国雅培公司，操作按说明书进行.检测BALB/c小鼠抗HBs 试剂盒购自北京万泰实业有限公司，操作按说明书进行，测定吸光度（A）值A450nm (临界值为010) .小鼠细胞因子分泌T细胞数量用固相酶联免疫斑点实验（ELISPOT）检测，操作按说明书进行，试剂盒购自法国DiaClone公司.

　　统计学处理：运用SAS81进行统计分析.抗HBs检测结果及血清平均HBsAg浓度采用重复测量方差分析，P<005表明差异具有显著性.

　　2结果

　　21BALB/c小鼠产生抗HBs（所有标本25倍稀释）HBsAg单独注射组抗HBs 滴度随时间逐渐增高，至首次免疫后16 wk达高峰，CpG ODN联合HBsAg诱导抗体效价随时间逐渐增高，首次免疫后8 wk达高峰，之后呈下降趋势，在同期较HBsAg单独注射升高，尤其在首次免疫后6、8、12 wk 两组比较差异显著（P<005），至16 wk A均值虽较HBsAg组高，但无统计学差异（P>005），联合免疫较CpG ODN单独免疫自首次免疫后4~16 wk差异显著（P<005，Tab 1）.表1BALB/c小鼠免疫后抗HBs检测结果A均值（略）

　　22HBV转基因小鼠产生抗HBs（>10 U/L为阳性）CpG ODN联合HBsAg组小鼠抗HBs在首次免疫后1 mo有3只阳性，几何均数为376，3 mo有7只阳性，几何均数为2294，6 mo有9只阳性，几何均数为14470 (Tab 2)，呈逐渐升高趋势，而HBsAg组12只小鼠及寡脱氧核苷酸组8只小鼠在免疫后各时间点抗HBs均阴性.表2转基因小鼠免疫前后血清平均HBsAg浓度(S/N)变化（略）

　　23HBV转基因小鼠循环HBsAg（>2为阳性）各组小鼠血清HBsAg免疫前全部阳性，免疫后1，3,6 mo各组血清HBsAg均下降, OS组下降更明显，第1时间点与后3个时间点间有统计学差异（F=4545,Ｐ<00001），各个时间点3组之间无统计学差异（F=271, P =00836，Tab 3）.

　　24BALB/c小鼠细胞因子分泌T细胞我们采用抗IFNγ ELISPOT 方法评价HBsAg、CpG ODN单独免疫及二者联合免疫BALB/c小鼠后脾HBsAg特异性T细胞的数量.每条图代表用HBsAg 刺激后形成点的脾细胞均值，每孔(2～5)×105细胞.与HBsAg，CPG ODN 单独免疫比较，联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFNγ的脾细胞分别增加3 和10倍(Fig 1).

　　25转基因小鼠细胞因子分泌T细胞采用抗IFNγ ELISPOT 方法评价HBsAg、CpG ODN单独免疫及二者联合免疫转基因小鼠后脾HBsAg特异性T细胞的数量.每条图代表用HBsAg 刺激后形成点的脾细胞均值，每孔（2～5）×105个细胞.结果显示，与HBsAg，CPG ODN 单独免疫比较，联合免疫使HBsAg特异性分泌IFNγ的脾细胞分别增加3和11倍(Fig 2).

　　3讨论 

　　Davis等［1］报道，应用CpG ODN联合重组HBsAg可诱导BALB/c小鼠产生Th1免疫反应，增强免疫小鼠HBsAg特异性抗HBs反应，抗体类型以IgG2a为主，并可诱导强烈的CTL反应， Malanchere等［3］报道，应用CpG ODN联合重组HBsAg可诱导HBsAg转基因C57BL/6J小鼠产生Th1免疫反应，清除循环中HBsAg同时出现特异性抗体抗HBs，明显下调肝内HBV mRNA表达，并可诱导强烈的CTL反应，表明CpG ODN可作为HBsAg疫苗佐剂增强抗原特异性的体液免疫和Th1细胞免疫.CpG DNA所诱导细胞因子持续时间不超过24 h［4,5］.因此我们采用抗IFNγ ELISPOT 方法评价CpG ODN对HBsAg诱导细胞免疫的影响，ELISPOT是一种在单细胞悬液中定量检测细胞因子生成细胞的分析方法，此方法操作简便，但却能提供非常类似于体内实验的环境.结果显示CpG ODN可明显增加小鼠HBsAg特异性IFN分泌性T细胞数量，表明增强了Th1型细胞免疫，这与慢性乙型肝炎HBV的清除有密切关系.CpG ODN ,HBsAg共注射HBsAg转基因小鼠，可打破转基因小鼠对HBsAg的免疫耐受，诱导抗HBs的产生，而单独注射HBsAg 或CpG ODN均不能诱导抗体的产生.HBsAg 转基因小鼠抗体的产生需通过CpG ODN强烈活化Th细胞为抗体的产生提供帮助，同时，CpG ODN 还可以T细胞非依赖方式直接活化B淋巴细胞，使其增殖，与通过抗原受体方式B细胞活化协同作用，促进抗体的产生［6］.虽然联合免疫诱导转基因小鼠产生抗HBs，但血清HBsAg未完全清除，且单独CpG ODN 或HBsAg组血清HBsAg也下降，原因可能与我们的实验中HBsAg用量较大，每只10 μg，连用3次，起到部分免疫调节作用，但未能诱导抗体产生.

　　转基因小鼠表达的HBsAg不能诱导表面抗体和特异性的细胞免疫应答的机制尚未完全明确，可能与小鼠在发育阶段免疫系统接触大量表面抗原，使转基因小鼠树突状细胞（DC）对HBV抗原递呈功能低下，从而使T细胞及B细胞免疫活化受到抑制，肝细胞（HC）应答能力减低，不能有效清除HBV有关，其中DC功能低下起关键作用［8］.我们实验可使小鼠脾细胞抗原特异性分泌IFN γ的T淋巴细胞数量增多，其机制可能通过CpG ODN增强活化DC提供的共刺激信号及I型IFN的产生，而增强TC的活化.

　　【】

　　［1］ Davis H, Weeranta R, Waldschmidt T J, et al. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis surface antigen ［J］. J  Immunol，1998；160:870-876.

　　［2］ Jung M C, Hartmann B, Gerlach J T, et al. Virusspecific lymphokine production differs quantitatively but not qualitatively in acute and chronic hepatitis B infection ［J］. Virology，1999；261:165-172.

　　［3］ MalanchèreBrès E,Payette P J, Mancini M, et al. CpG Oligodeoxynucleotides with hepatitis B surface antigen (HBsAg) for vaccination in HBsAgtransgenic mice ［J］. J  Virol，2001；75(14)：6482-6491.

　　［4］ Klinman D, Yi AK, Beaucage S L, et al. CpG motifs expressed by bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete IL6, IL12 and IFN ［J］. Proc  Natl  Acad Sci USA，1996；93:2879.

　　［5］ Yi A K, Klinman D M, Martin T L, et al. Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA: Systemic induction of IL6 transcription through an antioxidantsensitive pathway ［J］. J Immunol，1996；157: 5394.

　　［6］ Krieg AM. Immune effects and mechanisms of action of CpG motifs ［J］. Vaccine, 2000；19:618-622.

　　［7］ 熊一力，刘光泽，贾彦征. HBV转基因小鼠免疫耐受机制的实验研究［J］. 世界华人消化杂志, 2002;10（6）:642-645.