非小细胞肺癌组织中血小板反应素的表达和血管生成的关系

            作者：董济民，呼晓荣，孙埃雄，何积银，李秀霞 

【关键词】  凝血酶敏感

    Thrombospondin1, microvessel density in primary nonsmall cell lung cancer and their clinical relevance

　　【Abstract】AIM：  To explore the relationship between the expression of thrombospondin (TSP) and angiogenesis in nonsmall cell lung cancer (NSCLC). METHODS: By using SP immunohistochemistry stainning method, expression of TSP1 and TSP2 and microvessel counting were evaluated in surgically resected specimens from 55 patients with NSCLC and 30 adjacent normal tissues using the antiTSP1, antiTSP2 and antiCD34 monoclonal antibodies, respectively. RESULTS:  Active angiogenesis was observed in NSCLC tumor tissues. The microvessel density (MVD) was related to metastasis and the clinical stage of NSCLC. TSP1, TSP2 expressed mainly in the cytoplasm, nuclear and extracellular matrix. The expression of TSP1 and TSP2 in the 55 tumor tissues was significantly higher than that in the 30 adjacent normal tissues（158.70 ± 211 versus 14120±7.20 and 149.10±2.94 versus 145.70±［yn1］4.74, respectively, P<0.05）. The expression of TSP1 and TSP2 in NSCLC patients was related to the clinical stage and metastasis of NSCLC. There was a negative correlation between TSP1, TSP2 expression and MVD (r＝-0.964,-0.876, respectively, P<0.05). TSP1 played a more important role. CONCLUSION:  It indicates that TSP1 and TSP2 are closely correlated to the angiogenesis of NSCLC. TSP1 and TSP2, together with MVD, may serve as clinical predictors for the metastasis of NSCLC.

　　【Keywords】  carcinoma, nonsmall cell lung; thrombospondins; microvessel density; immunohistochemistry; image analyze gray value

　　【摘要】目的： 探讨血小板反应素（TSP）的表达及微血管密度（MVD）改变与非小细胞肺癌(NSCLC)的关系.方法： 用SP免疫组织化学技术，检测了55例NSCLC癌组织和30例肺癌旁组织中TSP1和TSP2的表达及MVD的改变.结果： NSCLC癌组织中存在活跃的血管生成；MVD与NSCLC侵袭转移和临床分期有关.肺癌组织中TSP1和TSP2阳性表达的图像分析灰度值（1587±21和1491±29）明显高于30例肺癌旁组织阳性表达的图像分析灰度值（1412±72和1457±47）（P<005）； TSP1和TSP2阳性表达与NSCLC患者的病情进展和转移明显有关.TSP1和TSP2表达与MVD成负相关(r＝-0964，-0876,P<001)，且TSP1起更重要的作用.结论： TSP1和TSP2与NSCLC的血管生成有密切关系.TSP1和TSP2及MVD是临床估计NSCLC病情进展和侵袭转移的重要标志.

　　【关键词】 癌，非小细胞肺; 凝血酶敏感，蛋白类;微血管密度；免疫组织化学；图像分析灰度值

　　0引言

　　实体瘤的持续生长依赖于肿瘤血管生成.抑制肿瘤的血管生成可阻止肿瘤的生长、转移.血小板反应素 (Thrombospondin，TSP)家族中,TSP1和TSP2均具有影响血管生成的功能［1］.我们检测非小细胞肺癌（NSCLC）癌组织和30例肺癌旁组织中TSP1和TSP2的表达及微血管密度（MVD）的改变如下.

　　1 材料和方法

　　11材料

　　1996/2001年手术切除石蜡包埋,并经病理证实为非小细胞肺癌标本55例.术前未接受化放疗.同时取癌旁5 cm以远正常无明显炎症肺组织30例.鼠抗人TSP1,TSP2均购于美国NEOMARKER公司；鼠抗人CD34 mAb、生物素标记的羊抗鼠IgG及SP试剂盒均购自北京中山生物技术公司.

　　12方法

　　石蜡包埋标本切成5 μm厚连续切片4张，其中1张行HE染色，复核病理诊断，另3张采用免疫组化SP法检测TSP1和TSP2及 CD34蛋白表达.CD34阳性对照为已知阳性扁桃腺和脑胶质细胞瘤的血管内皮细胞膜/质.TSP1，TSP2阳性对照为扁桃腺切片中的血小板、单核细胞和巨噬细胞.阴性对照为PBS缓冲液分别代替一抗、二抗经上述步骤染色作对照.TSP1，TSP2表达阳性细胞为肿瘤细胞胞质及细胞外基质呈棕黄色染色，明显高于背景（或背景不着色而细胞着色者）.以阳性细胞显色强度为标准，进行图像灰度.（用图像分析系统Quantimet 570,Leica, 德国）定量分析.灰度值与阳性强度呈反比表示.采用Weidner等（1992）方法测定血管生成和微血管密度（MVD）.

　　统计学处理：所有数据用x ±s表示,应用SPSS100统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析（AVONA），两组间比较采用t检验(方差不齐时用t′检验)，指标间相关性分析采用线性相关. P<005为有统计学意义.

　　2结果

　　21NSCLC组织微血管密度 （Tab 1）NSCLC组织55例的平均MVD (419±23)个微血管/mm2明显高于30例肺癌旁组织（299±38）个微血管/mm2，其差别具有统计学显著性（P<005）.条NSCLC组织Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者的平均MVD高于Ⅰ期患者，Ⅲ 期和Ⅳ期高于Ⅱ期，（P<005）；39例出现转移的NSCLC患者MVD明显高于16例未转移患者（P<005）；MVD在不同年龄、性别、病理类型及病理分级间无统计学显著性（P＞005,Tab 1）.表1 NSCLC组织MVD与TSP1、TSP2表达（略）

　　22NSCLC组织TSP1和TSP2表达TSP1，TSP2的阳性产物主要分布于癌细胞的胞质内，呈棕黄色，细胞核也有着色；肺癌间质及巨噬细胞胞质内也有TSP1和TSP2阳性表达.NSCLC组织TSP1和TSP2表达灰度值（1587±21和1491±29）高于癌旁组织（1412±72和1457±47），差异显著（P<005）.而且NSCLC组织TSP1表达比TSP2表达更低（P<005）.相反，肺癌旁组织TSP1表达比TSP2表达更高（P<005）.在NSCLC组织中随TNM分期增高，TSP1和TSP2表达的灰度值逐渐升高，各期间差异显著（P<005, Tab 1）；随着分级增高TSP1和TSP2的图像分析灰度值随之增高，但各级间差异无显著性（P＞005）；转移者TSP1和TSP2的灰度值高于无转移者, 差异显著（P<005 ）.TSP1和TSP2表达的灰度值在不同年龄、性别、病理类型及病理分级间无统计学显著性（P＞005）.

　　23TSP1、TSP2表达与MVD的关系在NSCLC组织中,TSP1 和TSP2表达呈正相关（r=0834, P<001），且TSP1表达（1587±21）低于TSP2表达（1491±29）（P<005）；TSP1 和TSP2表达均与MVD呈负相关（r=-0964，-0876,P<001）.

　　3讨 论

　　肿瘤的发生、和转移依赖于肿瘤的血管生成［2］.本结果表明NSCLC中的确存在活跃的血管生成；随着TNM分期的进展，微血管密度值MVD逐渐增高,而且，MVD高者更易发生转移.说明MVD可以较好地反映NSCLC患者的病期进展，与NSCLC的临床分期和侵袭转移密切相关［3］.血管生成受血管生成促进因子和抑制因子双方面调控.血管生成促进因子的增多或抑制因子的减少，都可促进肿瘤血管的生成.TSP1和TSP2均与抗血管生成有关，是内源性的血管生成抑制因子，在肺组织和多种肿瘤组织中均有表达［4］.在结肠癌、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中TSP1和TSP2表达降低或不表达.我们发现TSP1和TSP2的表达与患者的年龄、性别无关；且与NSCLC组织学分型及肿瘤组织的分化程度无关.与癌旁组织相比，NSCLC组织的血管生成明显，TSP1和TSP2的表达较低； TSP1和TSP2的表达与MVD成负相关（r=-0964，-0876,P<001）.提示TSP1和TSP2的低表达是肺癌血管生成增加的因素，TSP1和TSP2具有抗血管生成作用，因而肿瘤组织呈现显著的血管生成.来自其他的肿瘤［5，6］研究也间接支持我们在NSCLC中的发现.本研究显示，NSCLC中TSP1和TSP2的阳性表达与分期及转移均成相反关系；该结论与Kadama 等［7］对卵巢癌及Van等［8］对宫颈癌的研究结论一致.我们还发现，在NSCLC组织中，TSP1比TSP2的表达更低，相反，在癌旁组织中, TSP1比TSP2的表达更高.提示在抗肿瘤的作用中，TSP1比TSP2起更重要的作用.

　　【】

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