大黄素抑制体外淋巴细胞增殖的作用研究

【关键词】  淋巴细胞；细胞增殖；大黄素；免疫耐受

　　Inhibitory effects of emodin on proliferation of human lymphocytes in vitro

　　【Abstract】 AIM: To evaluate the inhibitory effects of emodin on proliferation of human lymphocytes in vitro and to explore its possible mechanism. METHODS: Human peripheral blood lymphocytes isolated from healthy donors were cultured with phytohemagglutinin (PHA), interleukin2 (IL2) or mixed leukocyte culture (MLC),  respectively. Interfered by different agents, emodin and CsA, the proliferation of human lymphocytes was  observed by MTT. RESULTS: In the range of concentrations from 3×10-6 mol/L to 3×10-5 mol/L, emodin could suppress the proliferation of lymphocytes induced by PHA, IL2 or MLC obviously, and showed a positive concentrationdependent inhibitory effect. And also emodin had a synergistic effect with CsA  in  immunosuppressive behavior. CONCLUSION: Emodin exerts its immunosuppressive effects through inhibiting the proliferation of lymphocytes in vitro.

　　【Keywords】 lymphocytes; cell proliferation; emodin; immune tolerance

　　【摘要】 目的：研究大黄素的体外免疫抑制作用，探讨其可能的作用机制. 方法：通过PHA，IL2及MLC活化淋巴细胞，给予大黄素和CsA干预，采用MTT法观察比较大黄素和CsA对淋巴细胞活化的抑制作用. 结果：在3×10-6～3×10-5 mol/L的浓度范围内，大黄素对PHA，IL2及MLC引起的淋巴细胞活化表现出明显的抑制作用，其作用随浓度增加而增强，并与CsA具有协同性. 结论：大黄素在体外通过抑制淋巴细胞增殖来发挥其免疫抑制作用.

　　【关键词】 淋巴细胞；细胞增殖；大黄素；免疫耐受

　　0引言

　　大黄素（emodin）属蒽醌类，是蓼科植物提取的主要成分. 具有抗肿瘤、抗炎抑菌及保护肝肾等作用［1-3］. 我们观察emodin对离体淋巴细胞活化的影响，并与环孢素A（CsA）比较，研究两者的协同性，以探讨emodin在移植免疫抑制中的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料emodin（标准品）由陕西省药品检验所提供；CsA由Novartis公司提供；淋巴细胞分离液、四甲基偶氮唑盐（MTT），重组人IL2均购自晶美公司；新生牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供；RPMI 1640，植物血凝素（PHA）分别购自Gibco公司和上海市医学化验所.

　　1.2方法实验分为正常对照组、 CsA组（1 mg/L）， emodin大（3×10-5mol/L），中（1×10-5 mol/L），小剂量组（3×10-6 mol/L），CsA与emodin联用组（1mg/L CsA ＋1×10-5 mol/L emodin）. 外周血淋巴细胞（PBMC）取自健康成年人静脉血，细胞密度为1×109/L，按200 μL/孔培养于96孔培养板中，每组设6个复孔，同时设2个复孔对照（不加细胞，其他同实验孔），置入37℃ CO2的孵育箱中培养. ①PHA与IL2刺激组： 分别将PHA溶液按1∶50的比例、IL2贮存液按1∶40的比例加入淋巴细胞悬液中，分组给药后培养. ②MLC组：采用双向混合淋巴细胞培养，取两位健康成年人无菌外周静脉血，分别制备外周血淋巴细胞（方法同前）. 将供者、受者淋巴细胞每孔分别加入各100 μL，分组给药后培养. 培养24, 48, 72 h后用四甲基偶氮唑盐（MTT）法于酶联免疫分析仪上检测各孔的吸光度（A）值. 淋巴细胞增殖抑制率（%）=［1－（实验孔A值－本组对照孔A值）/（空白组A值－空白组对照孔A值）］×100%.

　　统计学处理：数据均用x±s表示，各组淋巴细胞增殖抑制率比较用重复测量设计的方差分析（SPSS 10.0软件包）. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　在PHA，IL2刺激或混合淋巴细胞培养后24，48，72 h后，emodin对不同刺激原引起的淋巴细胞增殖较正常对照组均表现出与CsA组一致的抑制作用（P<0.05），但其抑制强度弱于CsA组（图1～3）. 在48和72 h，CsA与大黄素联用组表现出较CsA单剂组更高的淋巴细胞增殖抑制率，但组间差异无统计学意义（P>0.05）. 在3×10-5～3×10-6 mol/L的浓度范围内，抑制率表现出一定的剂量依赖性（P<.05，图4）. 同时，各实验组对淋巴细胞增殖的抑制作用均表现出随作用时间推移而呈逐渐增强趋势.

　　图1PHA组不同药物的淋巴细胞增殖抑制率（n=6）（略）

　　图2IL2组不同药物的淋巴细胞增殖抑制率（n=6）（略）

　　图3MLC组不同药物的淋巴细胞增殖抑制率（n=6）（略）

　　图4不同浓度大黄素的淋巴细胞增殖抑制率（PHA刺激组）（n=6）（略）

　　3讨论

　　细胞免疫应答是移植排斥的主要机制［4］. Emodin具有多种药理作用，移植术后患者在服用大黄制剂类药物后出现全血免疫抑制剂药物浓度增高［5］. 本结果表明emodin可以明显的抑制特异性及非特异性的淋巴细胞活化，在3×10-6~3×10-5 mol/L的浓度范围内emodin对淋巴细胞活化的抑制作用呈明显的量效依赖关系，这种抑制作用与阳性对照组（CsA组）相一致，同时，emodin亦表现出与CsA抑制淋巴细胞增殖活化的协同作用. 证明emodin能有效地抑制淋巴细胞活化后的克隆扩增，从而进一步影响免疫激活的后续环节.

　　【】

　　［1］ Huang Q, Shen HM, Shui G, et al. Emodin inhibits tumor cell adhesion through disruption of the membrane lipid raftassociated integrin signaling pathway［J］. Cancer Res, 2006，66（11）：5807-5815.

　　［2］   Basu S, Ghosh A, Hazra B. Evaluation of the antibacterial activity of ventilago madraspatana gaertn, rubia cordifolia linn and lantana camara linn: Isolation of emodin and physcion as active antibacterial agents［J］. Phytother Res, 2005，19（10）：888-894.

　　［3］  高志强，王彩茂. 大黄素与器官纤维化［J］. 中西医结合杂志， 2005，25（11）：1030-1032.

　　［4］   Junge G, Tullius SG, Klitzing V, et al. The influence of late acute rejection episodes on longterm graft outcome after liver transplantation ［J］. Transplant Proc, 2005, 37（4）：1716-1717.

　　［5］   纪松岗，徐霞，王春燕，等. 3例肾移植患者口服大黄制剂后引起环孢素全血谷浓度增高［J］.中国药师，2005，8（1）：48-49.