血管抑素抗肿瘤血管生成的研究进展
【关键词】 血管抑素 肿瘤 血管生成
血管生成是指已经存在于组织的成熟血管内皮细胞，通过增殖游走，以出芽或者嵌入的方式形成新生血管的过程。在胚胎形成、女性月经期子宫内膜的周期性重建、伤口愈合及组织器官慢性缺血缺氧等条件下，该过程的发生对机体的生长发育及生存有重要意义。然而，当恶性肿瘤发生时，血管生成过程同样会被启动，其速度可作为衡量疾病进展及判断预后的一项指标。如果没有新生血管的营养供应，实体瘤达到1～2mm直径和宽度时即进入休眠状态。因此通过人为干预的方式，抑制肿瘤血管生成过程，可达到抗肿瘤的目的。1994年发现和提纯的血管抑素［1］，因具有良好的抗肿瘤血管生成活性，受到了很大关注。
1 血管抑素的基本特征
血管抑素（angiostatin，AS）是一系列血浆纤溶酶原的天然蛋白分解产物。纤溶酶原是一种由791个氨基酸及一些糖链组成的糖蛋白，内部含有五个三环结构；每个三环结构均由隔着一个内含子的两个外显子编码的约80个氨基酸残基组成，其内部通过三个二硫键来维系结构的稳定。O’Reilly等首次提纯的AS被证明是纤溶蛋白酶原氨基酸中Thr98?Val440的一段序列，其N段为Thr98，C端为Val440，包含了纤溶蛋白酶原上具有高度同源性的前四个三环结构，这四个三环结构氨基酸序列的相似约为50%，半衰期2.5d。纤溶蛋白酶原上存在的第五个三环结构与前四个无同源性，半衰期更短，但其抑制血管生成的作用更强。此外，在纤溶酶原激活因子的N端和尿激酶中也存在着与之相似的三环结构，它们的存在对AS作用的发挥可能具有一定的意义。
由于纤溶酶原存在着不同的裂解位点，因此在不同的细胞环境中可以产生不同分子组成的裂解产物。已发现的AS主要有AS1～3、AS1～4、 AS4、 AS5、AS4.5、 AS1～5六种。动物实验中，AS具有强烈的抑制血管生成的能力，但不同结构的AS对同种内皮细胞的作用强度不同，其顺序分别为AS1～5> AS5> AS1～4>AS1> AS3,并且AS1～3的抑制作用比AS1～4强。生物学效应具有如下特点：（1）对新生血管内皮细胞的增殖有选择特异性的抑制作用，但对已静止和成熟的内皮细胞无作用；（2）对早期肿瘤、转移瘤及动物种植瘤的血管生成抑制作用强；（3）其抑制作用具有时间和剂量依赖性关系；（4）作为内源性血管生成抑制因子，无耐药现象，也未发现其有明显的不良反应；（5）其作用的发挥不依赖于机体的免疫反应。鉴于这些特性，AS有可能成为新的抗肿瘤药物。
2 AS的产生过程
AS在机体正常的情况下并不产生，原发肿瘤存在时，肿瘤直接或间接产生和活化多种基质酶性物质，使其水解活性增强，进而水解纤维蛋白酶原产生AS片段［2］。首先纤溶蛋白酶原在其激活因子作用下生成纤溶酶，纤溶酶经细胞分泌蛋白磷酸甘油激酶或自身自由巯基的介导使其二硫键被还原或断裂生成AS4.5，然后AS4.5在周围多种基质水解酶的作用下水解生成AS1～3或AS1～4。这些水解酶包括基质金属蛋白酶（MMP），巨噬细胞金属弹性蛋白酶，组织纤溶酶原激活剂(tPA)，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)等。
纤溶酶在细胞膜表面的自我裂解对于AS的产生同样具有重要意义。Hao等［3］证实肿瘤细胞膜上的β?actin可依赖于uPA诱导AS4.5的产生，但该过程不需要自由巯基介导。并且在与肿瘤细胞β?actin表达水平相当的正常细胞表面上也检测到了AS4.5的存在，但其产生速率较慢，与uPA的激活速率呈正相关。已知正常细胞表面uPA及uPAR抗原的表达水平较肿瘤细胞低，提示细胞膜上uPA及其受体uPAR的表达水平可能是β?actin介导的纤溶解酶转化为AS4.5的限速因素。Jurasz等［4］发现，血小板膜也可以为纤溶酶原向AS的转化提供作用位点，该过程也依赖于uPA的作用，但不需要MMP的参与，这说明AS在膜表面的产生需要uPA的激活，其过程与基质中有所不同。
3 AS的抗血管生成机制
AS抑制血管生成的机制目前还不是非常明确。但现在的研究已经证实，AS可通过作用于其靶细胞上的多个位点，诱导内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞增生，抑制管腔形成进而发挥其抗血管生成的生物学作用［5～7］。
3.1 细胞表面的F0?F1ATP合酶 F0?F1ATP合酶是存在于线粒体内膜上的一种将ATP合成与分解偶联在一起的结构酶，其催化反应部位位于F1β亚基上，但它必须在与α亚基结合后才有活性。
内皮细胞表面也有着F0?F1ATP合酶的分布。AS可通过直接与内皮细胞表面的F0?F1ATP合酶的αβ亚基结合，干扰ATP代谢的全过程［8］,也可与另一该酶抑制物IF1进行竞争［9］。IF1是一种可抑制ATP分解，但不能抑制ATP合成的F1抑制因子，在与F1结合后只能对内皮细胞的增生产生轻度抑制作用，IF1被认为是内皮细胞的一种保护性物质。AS可剂量依赖性地竞争性抑制IF1与F1的结合，阻断IF1使内皮细胞表面储存ATP的能力。有报道［10］说，AS1～5通过作用于内皮细胞膜表面的F0?F1ATP合酶直接诱导内皮细胞凋亡。
F0?F1ATP合酶也存在于某些肿瘤细胞的细胞膜上。AS酸性条件下可与肺腺癌A549细胞表面F0?F1ATP合酶结合，触发肿瘤细胞内的caspase级联反应，诱导细胞凋亡，AS在特定的肿瘤微环境下可直接作用于某些肿瘤细胞膜表面的F0?F1ATP合酶并对肿瘤细胞产生直接的细胞毒作用［11］。
3.2 annexinII annexinII是一种分子量为36kDa的钙离子和磷脂结合蛋白，也是AS、tPa、纤溶酶原的共同作用受体之一。AS与annexinII的结合可引起细胞外钙离子内流，引起细胞内钙超载，直接引起内皮细胞损伤，甚至诱导内皮细胞凋亡［12］。
浸润性乳腺癌MDA?MB231细胞可选择性表达annexinII，并按时间依赖性的方式产生纤溶酶，而恶性程度较低的MCF细胞不能表达annexinII，也不具备产生纤溶酶的能力，提示annexinII可能介导纤溶酶原向纤溶酶的转变，并参与恶性肿瘤的浸润和侵袭过程［13］。抗annexinII的单克隆抗体作用于Lewis肺癌细胞后，可使纤溶酶原的激活减少92.6%，而AS可使其纤溶酶的产生减少81.6%。推测AS与annexinII结合后产生的抑制内皮细胞迁移和管腔形成作用可能是通过阻断annexinII介导的纤溶酶的产生来实现的［14］。
3.3 VEGF VEGF最初是从肿瘤组织中分离提纯得到，其III型酪氨酸受体仅在内皮细胞表达，二者结合后可强烈促进血管内皮细胞分裂，增加血管通透性，进而促进血管生成过程。AS可明显抑制微血管内皮细胞内ERK?1的活化，使丝裂原AP?1的表达减少，从而阻断VEGF的促内皮细胞增殖作用［15］。但这种阻断作用是通过抑制VEGF与其受体的结合还是通过下调其受体的表达水平，现在还不清楚。Yang等［16］发现AS可显著降低离体及肝微小转移灶内黑色素瘤细胞VEGFmRNA的表达水平，说明AS还具有抑制某些肿瘤细胞产生VEGF的能力。
3.4 angimotin angimotin是存在于内皮细胞膜上的跨膜蛋白质，其氮端为保守的coiled?coil结构，碳端是有135个氨基酸残基组成的PDE结合区域，它们都位于细胞膜的内侧面，而二者之间AS结合区域（ABD）因其旁的疏水结构组成两个跨膜的螺旋结构而暴露于细胞表面。angimotin可增加内皮细胞的运动迁移，并且它的这种作用在AS与ABD结合后便受到抑制［17］。研究者发现angimotin作为一种连接蛋白，还参与血管形成过程中内皮细胞间紧密连接和中间连接的成熟,但它由此而控制的细胞膜通透性并未受到AS作用的影响［18］。
3.５ 其他 内皮细胞的迁移需要纤溶酶与其表面整合素α9β1结合及纤溶酶的接触激活作用［19］。AS不仅可非特异性地与tPA进行竞争，降低tPA作用，减少纤溶酶的产生，从而发挥其抑制纤溶酶介导的内皮迁移作用，还可通过与整合素αvβ3、α9β1结合，减少内皮细胞MMP?9等蛋白水解酶的分泌，阻止内皮细胞侵入细胞外间质。
对于AS是否可以阻断内皮细胞的有丝分裂过程，有研究表明AS不能抑制内皮细胞G1/Ｓ的转变，不能通过阻断内皮细胞有丝分裂过程来减少内皮细胞数量［6］。但也有人认为AS作为纤溶蛋白酶原的裂解产物，actin、tubulin可能是其潜在的作用位点，AS可通过该位点干扰细胞运动的基本成分，干扰G2/M期的转变，从而阻断内皮的有丝分裂和细胞生长［20］。
AS还可特异性地与肝细胞生长因子HGF竞争性抑制c?met的磷酸化过程，降低其下游分子Akt和ERK1/2的磷酸化水平［21］，可能干扰内皮细胞的糖代谢，抑制HGF介导的内皮增生迁移作用，并可能由此参与内皮细胞凋亡过程的启动。
另有研究［22］认为，AS可增加抑癌基因P53及其下游分子的表达，增强FasL介导的信号传导通路，减少AKT的激活。并且，K5还可以促进中性粒细胞的趋化，增加CD3（+）细胞特别是NKT细胞对肿瘤组织的浸润，以此来提高机体抗肿瘤的非特异性免疫能力［23］。
4 问题及展望
AS能够强烈抑制肿瘤组织的血管生成，有着高效、特异、广谱、低毒、不易产生耐药性的优点，为人们一些血管增生性疾病特别是恶性肿瘤带来了新的视点、方法和希望。但AS在体内半衰期短、应用剂量高、提纯花费昂贵、不易运输和储存，还可能对正常创伤修复及血管改建产生一定的影响。虽然这些问题及难点为它的广泛应用设置了障碍，但它克服了传统肿瘤治疗的缺点，依然有着很大的应用前景。
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