IL-1β对人晶体上皮细胞中NO和iNOS活性的影响

【关键词】  白细胞介素-1β;一氧化氮;诱导型一氧化氮合酶;人晶体上皮细胞;白内障

　　白内障是常见多发的眼科疾病，也是视力障碍和致盲的重要眼病之一，白内障囊外摘除联合人工晶体植入术是目前最有效的方法。但白内障囊外摘出术后的后囊膜混浊（后发障，posterior capsule opacification，PCO）发病率高，影响视力。在研究PCO的形成机制中，人们发现PCO是因残留的HLEC增生、迁移、分化、合成分泌细胞外基质，并逐渐纤维化，导致后囊膜增殖性改变，以及术后创伤和炎症反应而形成的。IL-1β是一种单核因子，能诱导晶状体上皮细胞的生物反应 ［1］ 。具有广泛的免疫调节作用，并有致热和介导炎症的作用，它的生物学功能是通过与相应高亲和力受体结合而介导的。经实验研究表明，IL-1β在白内障术后早期房水中的含量明显增高，有促进晶状体上皮细胞增殖和分化的作用 ［2］ 。NO是一种自由基性质的气体，易溶于水和脂肪，可在细胞内外自由弥散，在生物体内可作为介质、信使或细胞功能调节因子而参与机体的许多生物活动和病理过程。诱导型一氧化氮合酶（inducible NO synthase，iNOS）是体内催化NO合成的酶。人的视网膜、葡萄膜、睫状肌和房水通道中有iNOS的分布 ［3］ 。有报道认为，IL-1β可能是iNOS的诱导剂，但有关IL-1β诱导的iNOS在晶状体的表达情况却鲜有报道。本文旨在探讨NO和iNOS在IL-1β诱导的PCO形成中的作用，为进一步阐明PCO的发病机制提供可能的相关线索。
    
　　1 材料与方法
    
　　1.1 主要仪器 CO 2 培养箱（NAPCO5410）;超净工作台（苏州净化设备厂）;倒置相差显微镜（OLYM-PUS IMT-2）;超声波细胞破碎机（德国dr.hielscher UO2000H）;低温离心机（HERMLEZ283K）。
   
　　1.2 主要试剂 DMEM培养基，小牛血清（GIB-CO公司）;IL-1β（Sigma公司）;iNOS试剂盒（南京建成生物工程研究所）;MTT试剂（美国Fluka）;Griess试剂（Promega公司）;

　　1.3 方法
   
　　1.3.1 HLEC HLEC以含10%胎牛血清（FBS）与100mg/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养液培养及传代，以1×10 5 /ml的密度接种于培养皿中，细胞80%以上融合后，换无血清DMEM培养用于实验。

　　1.3.2 MTT实验 借助酶标仪测定反映增殖作用大小的光密度（OD）值:将细胞消化后调整细胞浓度，将100μl晶体上皮细胞以1×10 5 /ml的密度接种于96孔培养板中，加入0.00002，0.0002，0.002，0.02，0.2和2ng/ml的IL-1β100μl，在37℃孵育24h后，弃上清，PBS冲洗两遍，每孔加入100μl MTT溶液（5g/L），继续孵育4h，每孔加100μl二甲基亚砜，振荡10min后，用酶标仪于570nm处测定OD值。以不加入IL-1β的作为对照。

　　1.3.3 NO水平的测定 根据Griess反应原理，测定细胞培养上清液中NO水平:培养上清液经离心后取100μl加入等量的Griess反应液（1%磺胺、0.1%N-1-萘乙二胺）混匀，室温放置10min，用酶标仪于540nm处进行光密度测定，根据标准曲线换算为NO浓度。
    
　　1.3.4 iNOS活性的检测 按照试剂盒操作方法进行检测，取上清液，加入反应底物:L 2 精氨酸，辅酶，NADPH等和呈色剂振荡，因iNOS催化L 2 精氨酸生成NO，而NO与二价铁配合物（呈色剂）形成有色物，在540nm波长处测定其消光值大小，即代表iNOS活性。
   
　　1.3.5 统计学分析 采用单因素方差分析进行组间比较，所有结果均经过3次以上重复实验。

    
　　2 结果
    
　　2.1 IL-1β对HLEC增殖作用的影响 与对照组比较，除2ng/L组外，其余浓度为0.00002～0.2ng/L的IL-1β增殖效应均明显大于对照组（P<0.05），结果见表1。
    
　　表1 IL-1β对HLEC增殖作用的影响（略）

　　注:0ng/L为对照组，与0ng/L比较，1）P<0.05，n=4

　　2.2 IL-1β对晶体细胞NO水平及iNOS活性的影响 对照组和0.00002ng/L IL-1β组NO水平较低，用本研究中实验方法未检测出，晶体细胞内的iN-OS水平在0.0002ng/L组开始增高，0.2ng/L组达最高水平，与对照组相比差异显著（P<0.05）（表2）。
    
　　表2 IL-1β对HLEC内NO含量和iNOS活性的影响（略）

　　注:0ng/L为对照组，与0ng/L比较，1）P<0.05，n=4
    
　　3 讨论
    
　　关于IL-1β的研究已经表明，HLEC可合成IL-1β，它能促进HLEC增殖，从而参与PCO的形成。本研究结果显示，经IL-1β处理的培养的HLEC不仅iNOS活性增高，而且其培养液上清中NO终末产物硝酸盐及亚硝酸盐水平均明显增高，进一步支持HLEC在IL-1β作用下，能产生过多的NO，参与PCO过程的假设。本实验用MTT法检测显示，除2ng/L的IL-1β外，其余各浓度IL-1β作用于HLEC24h后，均可促进HLEC增殖作用，说明IL-1β在人的PCO过程中可能发挥了重要作用。因此，我们认为NO和iNOS在IL-1β所致的PCO中可能发挥一定的作用。NO是体内重要的生物活性分子和信号分子，它作为血管扩张因子、神经递质、抗微生物效应分子和免疫调节剂具有多种生理和病理功能。NO是在NOS作用下，由L 2 精氨酸转化形成，NOS有三种同工酶，即神经型（nNOS）、内皮型（eNOS）和诱导型（iNOS），其中iNOS主要是在病理情况下诱导生成，催化机体产生大量的NO，参与血管生成、肿瘤的发生、和转移等过程 ［4］ 。根据本实验研究结果，可推断IL-1β在诱导HLEC增生的过程中，NO和iNOS发挥了重要作用，至少部分参与了PCO的发生和发展。关于IL-1β诱导的iNOS的mRNA和蛋白表达还有待于进一步研究。有人认为NF-κB途径参与调节了iNOS的mRNA表达，也有实验表明，结果表明ERK信号途径参与了LPS介导的人内皮细胞iNOS表达和NO产生 ［5］ ，还有人发现，p38MAPK活化介导iNOS的活化，然后活化COX2 ［6］ ，但其它信号转导途径与iNOS的mRNA和蛋白表达的关系以及其它可能参与的机制还有待于在今后的工作中进一步研究。
    

【】
  　　［1］邓小艳，蔡小军，柯治生.IL-1β，IL-6反义寡核苷酸脂质体抑制兔后发性自内障［J］.眼科新进展，2006，26（5）:348-350.

　　［2］柯治生，蔡小军，邓小艳.兔后发性白内障房水中自细胞介素-1β和白细胞介素-6的含量［J］.眼视光学杂志，2005，7（1）:33-36.

　　［3］庞广仁，丁行振，邓新国等.氧化应力对晶状体一氧化氮和一氧化氮合酶活性的影响［J］.眼科研究，2000，18（3）:210-212.

　　［4］ Moncada S，Higgs A.The L-arginine-nitric oxide pathway ［J］.N Engl J Med，1993，329:2002-2012.

　　［5］阚文宏，黄绪亮，姜勇，等.ERK信号转导途径在LPS诱导的人类内皮细胞iNOS表达中的作用［J］.微循环，2002，6（5）:308-309.

　　［6］韩君勇，陈运贞.大鼠心肌细胞缺氧预处理中COX2、iNOS和p38MAPK间信号转导关系的研究［J］.中国病理生杂志，2003，19（10）:1407-1410.