非小细胞肺癌中微血管密度和血小板凝集素1表达的研究
作者：陈志军 乐涵波 张永奎 钱立勇 李伟栋
【摘要】 目的 研究微血管密度（MVD）和血小板凝集素1（Thrombospondin-1，TSP-1）的表达与非小细胞肺癌（NSCLC）组织生物学行为的关系。 方法 用免疫组化法检测42例NSCLC组织和40例肺癌旁组织中TSP－1的表达及MVD的改变。 结果 NSCLC组织中MVD明显高于正常肺组织，MVD与淋巴结转移及临床分期有关。NSCLC组织中TSP-1的阳性表达率显著低于正常肺组织。TSP-1的表达与淋巴结转移、病理类型和临床分期有关。鳞癌组织TSP-1表达阳性者MVD比TSP-1表达阴性者明显下降。而腺癌组织中TSP-1表达阳性者MVD与TSP-1表达阴性者MVD无统计学差异。 结论 MVD是反映NSCLC患者病期进展的良好指标，TSP-1的低表达与非小细胞肺癌的浸润性有密切关系。其机制可能不仅仅与影响肿瘤血管生成有关。
【关键词】 非小细胞肺癌 血小板凝集素1 微血管密度 免疫组织化学
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of microvessel density (MVD) and thrombosondin-1(TSP-1) expression and the biological behaviors for non-small cell lung cancer(NSCLC). Method MVD and TSP-1 expression in 42 cases of NSCLC and 40 cases of normal lung tissue was tested with immunohistochemisty methods . Results MVD in NSCLC was increased significantly than that in normal lung tissue. MVD is related with lymph nodes metastasis and clinical stage. The positive expression rate of TSP-1 in NSCLC is lower than that in normal lung tissue. The expression of TSP-1 is related with lymph nodes metastasis and clinical stage as well as pathological type. MVD in the cases with positive TSP-1 expression decreased obviously than that in the cases with negative TSP-1 expression for squamous cell carcinoma ,but not for adenocarcinoma cases. Conclusions MVD is a well progressive indicator for NSCLC. There is a close relationship between the low expression of TSP-1 and the aggressive development of NSCLC. TSP-1 might not be a simply anti-angiogenic factor.
【Key Words】 non-small cell lung cancer Thrombospondin-1 microvessel density Immunohistochemistry
新生血管的生成是实体肿瘤持续生长和转移的重要机制。肿瘤血管的生成受到许多因子的调节，目前对于许多促进血管生成的因子已经研究较多，如血管内皮生长因子（VEGF）作为促进血管生成的主要调节因子已得到的广泛的认同。而对于许多抑制血管生成的因子，目前的研究仍较少。TSP－1是一种内源性血管生长抑制因子，已有研究发现该因子在乳腺癌、皮肤癌等肿瘤中表达下降［１，２］，但其在肺癌组织的表达情况却报道较少。作者通过免疫组化法，检测非小细胞肺癌中TSP－1的表达及其与肿瘤血管生成的关系。
1 材料和方法
1.1 一般资料
收集2004至2005年在本院胸外科行根治术的非小细胞肺癌患者42例,其中男31例,女性11例；年龄38～76岁，平均56岁。术前均未接受化疗、放疗和抗血小板药物。所有病例经病理确诊。其中鳞癌17例、腺癌16例、细支气管肺泡癌6例、大细胞癌3例。临床分期：I期7例、II期12例、III期19例、IV期4例。将I期和II期归为早期组，III期和IV期归为晚期组。有淋巴结转移28例、无淋巴结转移14例。对照组40例，其中男29例，女性11例；年龄38～74岁，平均53岁。选用远离肿块＞15cm的外周正常肺组织。
1.2 主要试剂
鼠抗人TSP-1购于美国NEWMARKER公司，鼠抗人CD34mAb、生物素标记的羊抗鼠IgG及SP试剂盒均购自福州市迈新生物技术开发公司。
1.3 实验方法
标本均经10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋，5μm厚连续切片。用免疫组化SP法检测组织中TSP-1和CD34蛋白的表达。按实验说明书进行，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知的阳性切片同时同一条件下染色作阳性对照，DAB染色观察。
1.4 结果判定
所有染色切片均经3位医师采用双盲法阅片，TSP-1 DAB显色呈棕褐色，颗粒状，团块状或带状分布于细胞浆和细胞外间质中，无背景着色。每张切片在200倍普通光镜下随机计数10个视野，每个视野中计数100个肿瘤细胞。无阳性细胞为阴性;阳性细胞数<10%为弱阳性、10%～50%为阳性、>50%为强阳性。为便于统计分析，将阴性和弱阳性定为阴性组，将阳性和强阳性定为阳性组。
CD34显色呈棕褐色，特异性标记微血管，无背景着色。和背景区分清楚的棕染单个细胞和细胞簇都可作为一个血管计数；分支结构如果未和连续结构中断，应作为一个血管计数。每例肿瘤微血管密度(MVD)，应用CMIAS病理彩色图像分析系统测定。参照Weider［３］方法，先在低倍镜（×40）下扫视整个切片，确定3个高血管密度区，即“热点”，再在高倍镜（×200）下记数被染成黄色的微血管数目，结果用3个高倍镜视野下微血管数目的平均数来表示。
1.5 统计学分析
应用SPSS 11.0 统计软件进行数据分析，两组间均数比较采用t检验，两组间率的比较采用χ2检验。P<0.05有统计学意义。在比较各种不同类型NSCLC组织TSP-1表达和MVD及其相互关系时，因细支气管肺泡癌和大细胞癌例数较少，不记入统计。
2 结果
2.1 NSCLC 组织微血管密度
42例NSCLC组织内微血管密集分布，相互间联系紧密,而正常肺组织微血管分布均匀且少，其差别显著，晚期组MVD明显高于早期组，有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组；而MVD在不同年龄、性别、病理类型及分化程度间无显著性差异。
2.2 NSCLC 组织TSP-1表达
TSP-1在NSCLC组织中的阳性表达率明显低于正常肺组织的表达率。而在NSCLC各类型相互比较中，TSP-1在肺腺癌中的表达阳性率明显高于鳞癌。早期组TSP-1的阳性率明显高于晚期组。有淋巴结转移组TSP-1阳性率明显低于无淋巴结转移组。TSP-1 在不同年龄、性别及分化程度间无显著性差异。
2.3 TSP-1表达和MVD相互关系
在NSCLC总体中，TSP-1表达阳性者MVD与TSP-1表达阴性者无显著性差异，而在病理类型分层研究中，发现鳞癌组织TSP-1表达阳性者MVD比TSP-1表达阴性者明显下降。而腺癌组织中两者无统计学差异。
3 讨论
肿瘤的血管新生在肿瘤的发生、和转移中起着极其重要的作用［４］。一般认为，肿瘤的生长过程可分为2个阶段：(1)血管生成前期：肿瘤细胞主要依靠弥散作用摄取氧与营养物质并排泄代谢废物。此期肿瘤生长缓慢，不表现过度生长，也鲜见发生远处转移。(2)血管形成期：肿瘤内血管形成旺盛，新生血管不仅提供了肿瘤生长所必需的营养，也为转移提供了通路，肿瘤生长迅速，接近指数性生长，而且新生毛细血管基底膜呈节段性分布，比正常组织的成熟毛细血管对瘤细胞有更高的亲和性，促进瘤细胞向循环系统入侵，进入血管或淋巴管，发生系统转移。
在本试验结果中，发现NSCLC中的确存在活跃的血管生成，且随着TNM分期的进展，微血管密度值逐渐增高，而且，MVD高者更易发生转移, 说明MVD可以较好地反映NSCLC患者的病期进展，与NSCLC的临床分期和侵袭转移密切相关。
血管生成受血管生成促进因子和抑制因子双方面调控, 血管生成促进因子的增多或抑制因子的减少，均可促进肿瘤血管的生成。TSP-1是一种内源性的血管生成抑制因子，目前已有许多研究发现该因子在多种肿瘤组织中均有表达［５］。在肺癌组织中，有学者发现TSP-1的表达下降，其低表达是提示预后差的一项指标［６］。而Lee等［７］在小鼠黑色素瘤肺转移模型中，向小鼠体内转入TSP-1基因，结果发现，原发肿瘤和肺部转移肿瘤内的微血管密度明显降低，肿瘤的生长被明显抑制，小鼠生存期明显延长。
本研究发现TSP-1在NSCLC组织中的阳性表达率明显低于正常肺组织的表达率。早期组TSP-1的阳性率明显高于晚期组。有淋巴结转移组TSP-1阳性率明显低于无淋巴结转移组。提示NSCLC组织TSP-1的表达与肿瘤的浸润性发展具有非常密切的关系，TSP-1具有抑制恶性肿瘤的发生和浸润发展的作用。
而在TSP-1和MVD的相关性研究中，发现在鳞癌中，TSP-1表达阳性者MVD比TSP-1表达阴性者MVD明显下降。而在总体NSCLC组织及腺癌中，TSP-1表达阳性者MVD与TSP-1表达阴性者MVD无统计学差异。Yamaguchi［８］通过对199例NSCLC患者的TSP-1表达研究也发现，TSP-1具有抑制肿瘤进展，延长生存期的作用，在鳞癌组织中TSP-1的表达与MVD呈明显的负相关，而在腺癌中却不存在这种关系，这提示了不同组织类型的NSCLC有不同的MVD的调控机制，也提示了TSP-1抑制肿瘤进展的作用机制与组织学相关。在鳞癌组织中，TSP-1通过抑制肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的浸润性发展，已有研究发现TSP-1抑制肿瘤血管生成作用机制可能是诱导了活化的血管内皮细胞凋亡［９］。而在腺癌组织中，TSP-1可能存在一种另外的抑制肿瘤发展的途径。已有研究发现部分NSCLC患者在肿瘤发生、发展中本身不会生成血管，单靠肿瘤细胞的不断增生进展［１０］。另有学者发现TSP-1可以直接抑制肿瘤细胞的增殖［１１］，TSP-1在腺癌组织中可能就是直接肿瘤细胞的增殖，从而抑制肿瘤的发生和发展。
另发现，TSP-1在不同病理类型的肺癌组织中表达有明显差异，即腺癌>鳞癌。这可能是因为TSP-1的表达受癌基因和抑癌基因的调节，不同组织学来源的肺癌细胞癌基因或抑癌基因不同，因此其细胞受这些基因的调节也不相同，故生物合成TSP-1的能力也有所不同。因此，不同组织学类型的肺癌中TSP-1表达的差异是可以理解的。但是，这种差异的意义还有待于做进一步的研究。如能诱导肿瘤细胞分泌TSP-1，则对抑制恶性肿瘤、血管生成、转移发生和改善预后可能有重要临床价值，在这方面有待作进一步深入的研究。
【】
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