雷公藤多甙对类风湿关节炎患者滑膜细胞凋亡的影响
作者：周光伟 沈权 金若珏 王晓东 曾云祥 叶澄宇
【摘要】 目的 观察雷公藤多甙(Tripterygium Glycosides, TG)对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者滑膜细胞凋亡的影响，以揭示TGRA可能的作用机制。方法 体外培养RA患者滑膜细胞，加入不同浓度的TG，24h光镜观察其凋亡的形态学特征，并用流式细胞仪及TUNEL法检测滑膜细胞的凋亡。 结果 TG组凋亡细胞百分率(55±11.2)%，显著高于骨折（NC）组（P<0.01）。 结论 TG可诱导滑膜细胞凋亡，这可能是其治疗RA的作用机制之一。
【关键词】 类风湿关节炎 滑膜 雷公藤多甙 凋亡
资助项目：温州市鹿城区技术局资助项目(S040210)
【Abstract】 Objective To observe the effects of tripterygium glycosides(TG) on synoviocyte's apoptosis of rheumatoid arthritis( RA) , in order to explore the possible mechanism of TG in treating RA . Methods Synoviocyte from RA patients were cultured in vivo , different concentrations of TG were added , the morphological charactors of synoviocyte's apoptosis was observed under light microscope 24 hours later , flow cytometry and TUNEL were used to detect the apoptosis of synoviocyte . Results The apoptosic cells was 55%±11.2% in TG group ,which was significantly higher than that in bone fracture group（P<0.01）. Conclusions TG could induce the apoptosis of synoviocyte which may be one of its mechanism for treating RA.
【Key words】 Rheumatoid arthritis Synovium Tripterygium glycosides Apoptosis
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性自身免疫性疾病,发病机制尚未完全明确。Firestein等［１］认为可能是滑膜细胞凋亡机制障碍所导致的滑膜组织内细胞的增殖和死亡之间平衡失调而引起。雷公藤多甙（Tripterygium Glycosides, TG）是一种具有多种免疫调节作用的中药制剂，对RA有一定的疗效，但其作用机制尚不明确［２］。最近的研究表明，雷公藤能诱导多种细胞凋亡，但是否能诱导滑膜细胞凋亡,以及其抑制滑膜细胞增生是否和细胞凋亡有关尚未见有报道。本文对TG诱导滑膜细胞凋亡进行研究，旨在探讨其可能的药理机制。
1 对象与方法
1.1 病例选择
2004年9月至2005年11月本院住院的RA患者7例，其中男4例，女3例，年龄32～55岁，平均(40±2.3)岁；病程5～17年，平均(6.4±2.1)年。RA的诊断符合美国风湿病协会1997年制定的标准，并经术后病理检查确诊。另选７例骨折（NC）患者作为对照。
1.2 滑膜细胞的分离和培养
从膝关节滑膜切除术或关节置换术获得的滑膜组织剪成1mm2大小的碎块，加入0.05%Ⅰ型胶原酶消化3.5h，然后置于37℃的5%CO2培养箱中孵育24h，倒去未贴壁的细胞，剩余贴壁细胞继续培养，在100 ml内加10%小牛血清，在100U/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM 培养液（NY)瓶中继续培养，每3～4d换液1次。用于实验的细胞均为3～10 代之传代细胞，为成纤维细胞样滑膜细胞［３］。
1.3 TG诱导滑膜细胞凋亡
将对数生长期RA、NC患者的滑膜细胞调整为5×105/ml，并各分为4瓶，同时加入TG（新昌第二制药厂），调整加入量使TG浓度分别为5、10、20、30mg/L，放回37℃的5%CO2培养箱中继续培养，于加药后12、24、48、72h观察形态变化并进行相应实验。
1.4 凋亡形态学观察
定时将加药后的培养瓶取出，直接置于倒置显微镜下观察并摄相，观察结束后继续放回孵箱中，待下次观察。
1.5 流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡
收集适量细胞，PBS洗2次，加入70%乙醇固定30min，离心后PBS洗2次，弃上清液，保留0.5ml液体，将细胞吹打开，加入RNA酶（终浓度为45mg/L)，37℃，45min，再加碘化丙啶（PI，终浓度为50μg/ mL），4℃避光，染色1h。用流式细胞仪检测滑膜细胞的凋亡，激发波长为488nm，计数10000个细胞；用FACS can 软件进行数据分析，并给出散点图。
1.6 TUNEL法检测滑膜细胞凋亡
按说明书操作，将细胞涂片用4%多聚甲醛固定，室温30min，与0.3%H2O2甲醇阻断剂室温孵育30min，与0.1%TritonX-100通透液在冰浴中孵育2min，滴加50μl TUNEL反应混合液，湿盒孵育60min，再加入50μl转化剂-过氧化物酶（POD），37℃孵育30min，最后加入3',3'-二氨基联苯胺(DAB)底物溶液，在光镜下观察结果。
1.7 统计学处理
用SPSS 11.5软件，进行方差分析，数据以(x±s)表示。以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 滑膜细胞凋亡的形态学改变
光镜下，加药24h后两组细胞开始出现突触回缩，细胞由菱形变成不规则形，48h细胞变圆、变小，部分由贴壁变为悬浮，可见凋亡小体。TG组细胞出现变化最早（24h），数量最多。如图1。
2.2 图2 倒置相差显微镜下观察滑膜细胞凋亡(图中?所示，×４００)流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡结果 两组滑膜细胞加药处理后，凋亡细胞百分率均明显高于未加药前（P<0.01），RA组达到(56±11.4)%， NC组仅（15±1.8%）。如图2。
2.3 TUNEL法检测滑膜细胞凋亡结果
低倍镜下（×40）选择对照背景好、细胞分布均匀的5个区域，于高倍镜下（×200）选择400个细胞计数阳性细胞数，细胞凋亡百分率：凋亡百分率＝凋亡细胞个数/观察的细胞总数。阳性细胞染色呈棕色。各组细胞凋亡的百分率见表1，两组各浓度差异均有非常显著性(P＜0.01)。表1 TUNEL法检测各组细胞凋亡的百分率（略）
3 讨论
类风湿关节炎为一慢性、进行性、侵蚀性疾病，我国人群患病率大概为0.36%，约有400多万患者。在病程2年时50%患者有骨侵蚀, 20年后几乎每例患者均发生骨侵蚀，如不当,病情可逐渐加重,滑膜增生，骨关节软骨侵蚀破坏最后造成关节强直、畸形、功能丧失和不同程度的残废。
雷公藤的药用价值在我国明代已有记载，上世纪60年代开始用于治疗类风湿性关节炎等疾病，取得了显著的效果，但其抗风湿病的作用机制一直不十分明确，有报道TG可诱RA患者外周血中单个核细胞凋亡［４］，亦可诱导人体的前骨髓白血病细胞(ＨＬ 60)的凋亡。本试验证明TG也可诱导RA滑膜细胞凋亡。自身免疫病的产生可能与自身免疫细胞凋亡受抑制有关［５］。因此，促进引起自身免疫反应的这些细胞凋亡就可能是治疗该类疾病的一个潜在途径，说明TG对RA所涉及的自身免疫细胞凋亡机制障碍的调节可能是其免疫抑制作用的机制之一。
TG因其明显的毒副反应，如对性腺的抑制作用，肝、肾、中枢神经系统损害,中毒尚可致急性肾功能衰竭、亚急性肝坏死、染色体畸变等，其起效药物浓度与毒性反应浓度接近而使其临床应用受到限制。本试验所用TG诱导滑膜细胞凋亡的浓度与出现细胞坏死之浓度存在较大差异，此点可为临床合理选择治疗药量提供新的理论依据。张兴民等［６］的实验证明在类风湿关节炎滑膜细胞中的Bcl-2 mRNA有过量表达。Bcl-2的过量表达可抑制fas介导的细胞凋亡，致使凋亡异常。本研究免疫组化测定bcl-2基因蛋白的表达，原位杂交测定bcl-2基因mRNA的表达均是阴性。TG可诱导RA滑膜细胞凋亡的机制是否和Bcl-2等基因有关，及相互关系、机制等尚需进一步深入研究。
【】
1 Firestein GS, Yeo M, Zvaifler NJ. Apoptosis in rheumatoid arthritis synovium. J Clin Invest, 1995, 96:1631～1638.
2 Lipsky PE, Tao XL. A potential new treatment for rheumatoid arthritis: Thunder god vine. Semin Arthritis Rheum, 1997,26: 786.
3 Firestein GS, Yeo M, Zvaifler NJ. Apoptosis in rheumatoid arthritis synovium. J Clin Invest, 1995, 96:1631～1638.
4 王振刚，王芳，赖蓓.雷公藤多甙诱导类风湿关节炎患者外周血中个核细胞的凋亡.中华风湿病学杂志，2001，5:325.
5 Noriyoshi D, Howard D, Normal T, et al. Apoptosis and autoinnunity. Autoinnunity,1995，8：1.
6 张兴民,蒋明,郑德先,等,类风湿关节炎病人滑膜细胞增生与fas和bcl- 2基因的表达.中华医学杂志,1998，78:175～178.
