脂肪间充质干细胞的研究进展及临床展望

【关键词】  干细胞
    1  引    言

    目前干细胞的来源主要有两种，即胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)和成体干细胞(adultste cells，ASC)。ESC由于涉及伦理道德及对其分化能力控制等各方面问题，目前各国对ESC研究普遍持谨慎态度；而ASC存在取材困难，获得率低(约1×105骨髓间质细胞方能获取一个间充质干细胞)［1］等不利因素其临床应用前景也明显受到限制。在此情况下，人们从人脂肪组织抽吸物中获得了一种成纤维细胞形态的细胞群［2］，具有取材容易，获得率高，自我更新能力与多向分化潜能类似ASC等优势，因而有望成为组织工程和基因工程中新的干细胞来源，并且具有较好的临床应用前景。

    2  PLA细胞简介

    2.1  PLA细胞的发现  近年来发现，脂肪组织可分泌多种激素样物质，对机体内分泌环境具有调节作用，脂肪组织已不再是一个简单、被动的能量贮存场所，应作为重要的内分泌器官来进行研究［3］。由于干细胞研究中已发现越来越多的器官或组织分离出ASC，如神经干细胞、血液干细胞、骨髓间充质干细胞、肌肉干细胞、成骨干细胞、皮肤干细胞［4］等，而脂肪组织与骨髓组织一样均在胚胎发育过程中源自中胚层，因此能否从脂肪组织中有效分离出干细胞成为研究目的。2001年，Zuk等［2］以外科切除或吸脂方式获得人或大鼠的脂肪组织作为研究对象，按照Katz等［5］的干细胞分离方法，消化离心等单位处理脂肪组织后获得一个显微镜下呈成纤维细胞形态的细胞群，体外培养过程中发现该细胞群具有稳定的倍增效应和低衰老性，且能够向多种细胞类型分化，与干细胞所特有的多向分化潜能及自我复制能力等基本特征一致，命名为脂肪组织提取细胞(processde lipoaspirate cells，PLA细胞)。原代培养贴壁的细胞较少，传代后的细胞称为脂肪源性成熟基质细胞(adipos?derived adule stromal，ADAS)。

    2.2  形态和生长特点  ADAS细胞呈平行排列，漩涡样生长，细胞为梭形，胞浆和核仁丰富。传代培养中，经过多次传代(10～20代)，细胞的增殖速度无明显减慢，衰老和死亡细胞所占比例也很少。这表明脂肪组织蕴含丰富的ADAS细胞，且细胞体外扩增能力很强，易于传代培养［6］。

    2.3  免疫表型  用流式细胞仪和免疫组化方法研究发现，体外培养的ADAS细胞可表达如下蛋白。

    a)粘附分子：ADAS细胞始终表达tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和α4(CD49 d)；细胞间粘附分子1(ICAM?1，CD54)、endoglin(cd102)、血管细胞粘附分子(VCAM，CD106)及活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM，CD166)。但不表达神经细胞粘附分子(NCAM，CD56)、细胞间粘附分子3(ICAM?3，CD50)、整合素αb(CD11b)和β2(CD18)及内皮选择蛋白(E?selectin，CD62)；b)分子受体：可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体；c)细胞外基质蛋白和糖蛋白：ADAS细胞能生成Ⅰ和型胶原、骨桥蛋白、ostenectin、Thy?1(CD90)和MUC?18(CD146)；d)肌蛋白：能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白；e)造血细胞标记：不表达造血细胞标志物CD14、CD31或CD45；f)补体调节蛋白：确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白；g)组织相容性抗原：表达类组织相容性蛋白HLA?ABC，而不表达类蛋白HLA?DR。不同的试验结果结果有不同，但这种差异可能是在细胞分离、培养、纯正化方法不同，以及免疫组化技术和流式细胞仪敏感性的不同而造成。总的来说，PAL细胞的免疫表型与已经报道的骨髓间充质干细胞是相似的［7］。

    2.4  PLA细胞与充质干细胞(mesenchymal cell，MSC)的比较  脂肪组织与骨髓在胚胎发育过程中均源自中胚层，因而有学者对PLA细胞与骨髓来源的MSC在细胞形态、生长动力学、多向分化能力、细胞衰老性等各方面进行了比较，结果发现二者差异仅表现在以下几个方面［8］：a)来源及获取方式。MSC需要骨髓穿刺，经密度梯度离心方法获得，量较少；而PLA细胞来自脂肪组织抽吸物，简单消化离心等步骤即可获取，量较大；b)细胞表面抗原。MSC与PLA细胞在细胞表面表达的CD抗原大体一致，但表达的细胞黏附分子略有不同［9］；c)体外培养方式。MSC体外培养时，血清质量与来源对其生长和增殖有较大影响［10］，但PLA细胞体外增殖和分化时并不需要添加特殊血清。

    3  PLA细胞的多向分化潜能

    PLA细胞的获取与分化培养方法简单易行。外科手术或抽脂术获取脂肪组织后，参照Katz等［5］方法获得PLA细胞，整个分离过程仅耗时2 h，且获得量较大，300 mL脂肪抽吸物中一般均可得到2×106～6×106个PLA细胞。实现PLA细胞定向分化的基础培养基均为达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)，不同定向分化需加入不同的刺激因子。

    3.1  向软骨细胞分化  在培养基中加入转化生长因子(TGF?β)、Vc和地塞米松后，人类ADAS细胞能显示出成熟软骨细胞相关的生化标志。使用合适的三维支架培养1～2周后，ADAS细胞能分泌软骨细胞的细胞外基质蛋白和Ⅱ、Ⅳ型胶原及聚焦蛋白聚糖［11］。

    3.2  向成骨细胞分化  人和老鼠的ADAS细胞在有Vc、B?甘油磷酸、地塞米松和1.25?VD3的培养基中培养2～4周，可在细胞外基质中形成磷酸盐钙化沉积物，并且表达骨原性基因和蛋白质(包括碱性磷酸酶、成骨蛋白及骨钙素，骨连接素和骨桥蛋白的受体)。将ADAS细胞包埋入由羟磷灰石/磷酸盐三钙构成的多也渗透水立方体内，植入免疫缺陷的小鼠体中，6周后可产生来自ADAS细胞的新骨样组织。而且在相同的实验条件下，它可比骨髓间充质干细胞产生更多的骨祖细胞和细胞外钙化的基质成分［12］。

    3.3  向肌细胞分化

    3.3.1  向骨骼肌细胞分化  在加入马血清的培养基中，人类ADAS细胞能表达myoD和肌细胞生成素，骨骼肌转录调节因子。最终，细胞融合形成多核的肌管，并表达骨骼肌细胞谱系的标志蛋白，如肌球蛋白轻链激酶［13］。

    3.3.2  向心肌细胞分化  培养基中加入5?氮杂胞苷诱导培养1周后，ADAS细胞的形态发生改变，2周后细胞变成圆形，3周后细胞出现自发性搏动，并表达心肌细胞的特异性蛋白－肌钙蛋白Ⅰ［14］。从形态学、免疫组化和超微结构分析证明，这种分化的细胞有心室样和心房样细胞特性。

    3.3.3  向平滑肌细胞分化  自从人类ADAS细胞在体外培养中表达出a?平滑肌肌动蛋白，即提示它有修复胃肠道或泌尿管道平滑肌损伤的价值。实际上，外科医生已经开始探索其临床应用的可能性。Garcai等移植自体同源的人类ADAS细胞以修复因患克隆病而引起的直肠阴道瘘，并且观察到瘘管愈合良好［15］，说明自体同源的ADAS细胞可能成为极具价值的外科方法。

    3.4  向脂肪细胞分化  体外试验证明，人类ADAS细胞能够回到原始分化途径，形成脂肪组织。利用包括胰岛素、methylisobutylxanthine(一种磷酸二酯酶抑制剂，可提高CAMP水平)氢化可的松或地塞米松、吲哚美辛或噻唑烷二酮(一种能活化C配体的过氧化物酶增强剂)、泛酸、生物素和三碘甲腺原氨酸进行诱导培养。7～10 d后，经油红0或尼罗河红染色。发现ADAS细胞中充满含有中性脂滴的小泡，全盛脂肪酸结合蛋白aP2和脂蛋白酶，并分泌脂蛋白瘦素［16］。在多种动物模型(鼠、猪)中注入已分化或未分化的ADAS细胞并配合不同的生物材料，如藻酸盐、透明质酸、纤维胶、多聚乳酸等，均能形成脂肪。而且，使用多孔的生物材料能提高成脂的能力［17］。

    3.5  ADAS细胞向内皮分化  在半固体培养基中，可诱导鼠的ADAS细胞向内皮细胞分化，这些细胞呈现同种系细胞CD34＋和CD13＋的细胞特征，并自发表达内皮细胞表面标志CD31和von Willebrand factor(血管假性血友病因子)。将ADAS细胞移植到裸鼠内，能促进裸鼠局部缺血组织新血管形成以及在基质胶层上出现血管样组织结构［18］。

    3.6  ADAS细胞与造血  人类ADAS细胞能表达一些与骨髓间充质干细胞向造血细胞分化时表达相同的粘附蛋白。此外，ADAS细胞在培养中分泌许多骨髓间充质干细胞也能产生的细胞因子，包括M?CSF、GM?CSF、TNFa、IL?6、IL?7、IL?8、IL?11和干细胞生长因子。人类的ADAS细胞在与CD34＋造血干细胞联合培养时，能使CD34＋细胞扩增，并促使其向T、B细胞方向分化［19］。

    3.7  跨胚层分化  神经细胞源于外胚层。人和鼠的ADAS细胞在无血清培养基中，呈现出类似于神经细胞的双突起形态，也表达神经细胞相关蛋白：巢蛋白、中间丝M和NeuN以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。在加入吲哚美辛、胰岛素和丁羟茴醚培养基中，ADAS细胞也能产生相似变化。美国杜克大学Safford等发现大鼠ADAS细胞在诱导剂作用下，以分化出神经元和神经胶质细胞，进一步证实这些新的细胞也具有类似神经细胞的功能［20］。这些都说明ADAS细胞可向外胚层细胞分化。

    4  临床展望

    组织或器官缺损性疾病、退行性疾病及遗传性疾病是临床上治愈率极低的的疑难杂症，尝试通过组织工程技术将组织来源的干细胞先行体外扩增和定向诱导为所需细胞，再植入体内，来解决这一系列临床难题已成为研究热点。PLA细胞以其自体来源、低免疫性、容易获取、细胞充足、多向分化等特点，很有可能成为颇具优势的基因载体。目前已证实，人脂肪抽吸物来源的PLA细胞在不同细胞因子和激素条件下可转化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞等，且新近研究发现大鼠脂肪组织中的PLA细胞可能存在更多的定向分化潜能。同时，Morizono等报道证实，以腺病毒或豆状病毒转染PLA细胞，并将其定向分化为脂肪细胞或成骨细胞后，PLA细胞仍能稳定表达外源性基因，提示PLA细胞与毒结合应用可作为基因治疗的载体来表达外源性基因。尽管PLA细胞实际应用过程中仍存在一些亟待解决的问题，如体外培养是一种优化过的环境，而体外培养后的PLA细胞能否适应体内环境而继续生长分化；在体内PLA细胞分化控制过程中能否排除致瘤性风险及是否发生免疫紊乱等，但相信有关PLA细胞的研究仍然前景广阔，脂肪组织来源的PLA细胞未来极有可能会取代目前的干细胞源而成为组织工程、基因治疗的一个新的热点，并能解决一系列临床难题而具有良好的应用前景。

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