TGF-β及其伙伴分子Smad4在胃癌组织中的表达

            作者：李乐平　靖昌庆　刘洪俊　石玉龙　许晓群

【摘要】  　　目的:探讨TGF-β及其伙伴分子Smad4在胃癌组织中的表达。方法：利用逆转录（RT）－PCR技术测定胃癌组织TGF-βmRNA和Smad4mRNA水平，并分析两者与胃癌患者各项临床病理指标间的关系。结果:Smad4mRNA在胃癌组织中的阳性表达率明显下降。TGF-β和Smad4均与胃癌组织的分化程度、肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移和TNM分期有关。Smad4 mRNA在胃癌组织分化程度高、肿瘤＜5cm、浸润深度浅、无淋巴转移、TNM分期较早的患者中阳性表达率高。TGF-βmRNA在胃癌组织中的阳性表达率明显升高。TGF-βmRNA在胃癌组织分化程度高、肿瘤＜ 5cm、浸润深度浅、无淋巴转移、TNM分期较早的患者中阳性表达率低。胃癌组织中TGF-β和Smad4表达间呈负相关。结论:TGF-β和Smad4共同调节胃癌的发生、及其生物学行为。

【关键词】  胃肿瘤　逆转录-聚合酶链反应　转化生长因子β·Smad4基因

　　 The correlation of TGF-β and Smad4 in gastric carcinoma

       【ABSTRACT】 Objectives: To explore the correlation of Smad4 mRNA and TGF-βmRNA in gastric carcinoma. Methods: The presence of Smad4 mRNA and TGF-βmRNA was measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) from 61 gastric carcinomas and 39 normal controls. Results: The positive percentages of Smad4 mRNA in gastric carcinoma were lower than those of normal controls. The positive percentages of TGF-βmRNA in gastric carcinoma were higher than those of normal controls. The expressions of Smad4 mRNA and TGF-βmRNA were all related to histological differentiation, location, tumor size, infiltration, lymph node metastasis and TNM stage. Negative correlation occurred in Smad4 mRNA and TGF-βmRNA. Conclusion: TGF-β and Smad4 may be associated with the carcinogenesis, biological behaviors and prognosis of gastric carcinoma.

    【KEYWORDS】 Gastric neoplasms· Reverse transcriptase polymerase chain reaction·Transforming growth factorβ·Smad4 gene

    　　Smads作为转化生长因子（TGF）-β超家族细胞内信号传递的中介分子,调控着细胞膜至核的信号转导。我们通过检测胃癌组织中Smad4 mRNA  和TGFβmRNA的水平来探讨两者在胃癌组织中的表达及其两者间的关系。

    1　资料与方法

    1.1　临床资料　选择2002～2003年在山东省立胃肠外科手术切除并经病理证实的胃癌标本61例。61例患者中男33例，女28例；≤50岁者30例，＞50岁者31例。按Borrmann分型：Ⅰ型8例，Ⅱ型19例，Ⅲ型22例，Ⅳ型12例；按病理类型：乳头状腺癌13例，管状腺癌20例，低分化腺癌10例，黏液腺癌9例，印戒细胞癌6例，未分化癌3例。另取39例正常胃黏膜标本为正常对照。所取标本切取后用生理盐水漂洗干净后用液氮冷存备用。

    1.2　试剂与仪器　焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate ，DEPC)购自美国Sigma Chemical公司，溴化乙锭(Ethidium Bromide， EB)购自瑞士Fluka Chemie AG公司，1kb DNA Marker购自MBI公司，SORVALL T21高速低温离心机及配套转子为美国Sorvall Products公司产品，EC250-90多功能电泳仪为美国EC公司产品，ZF-4型多功能紫外投射反射分析仪为上海长明光学仪器厂制造。 PTC-150型PCR扩增仪为美国MJ Research公司产品，1D Image Analysis Software凝胶分析系统为美国Kodak公司产品。

    1.3　检测方法　①胃癌组织总RNA抽提及定量:取组织标本约100mg，移入组织匀浆器中，加入600ul GIT变性液，匀浆后吸取500μl至Eppendorf管中，每管加入pH4.02 MNaOAc 50μl，颠倒混匀；再加入500μl水饱和酚，轻轻混匀；最后加入100ul氯仿，颠倒充分混匀，冰浴10～15min。4℃12000rpm离心10min，吸取上清移至另一新1.5ml Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h。4℃ 15000rpm离心10min，弃上清，加入100μl GIT变性液，轻轻催打，使沉淀溶解，加入等体积的异丙醇，  -20℃放置1h。4℃ 15000r/min离心10min，弃上清，用无水乙醇洗一遍，弃上清，晾干，溶于适量的无Rnase的去离子水中，直接应用，亦可加入1ml无水乙醇于-70℃保存备用。②合成Cdna:采用 Promega 公司 RT-PCR(A3500) 两步法试剂盒 ,按操作说明进行将 RNA 逆转录成 cDNA。

    　　TGFβ1扩增片段为297bp

    P1   5'CAAGTGGACATCAACGGGTT3' 

    P2　5'GCTCCAAATGTAGGGGGCAGG3'

    Smad4扩增片段为461bp 

    P1　5'-AAGGATCAAAATTGCTTCAG-3'

    P2　5'-AGAGTATGTGAAGAGATGGAG-3'

    Humanβ-actin  扩增片段为539bp

    P1　5'- GTGGGGCGCCCCAGGCACCA -3'

    P2　5'- CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC -3'

    20μl 逆转录反应体系包括: 细胞总RNA 1μg、M-MLV 1μl、5×RT buffer 4μl、0.1mol DTT 2μl、4×dNTP 1μl、随机引物1μl、去RNase水补至20 μl，快速离心混匀；37℃ 1h，95℃ 10min灭活M-MLV；快速离心使蒸汽沉于管底。

    ③ＰＣＲ扩增：　取5ul RT产物的0.5ml Eppendorf管中继续加入以下试剂10×PCR Buffer 5μl 、25mM MgCL2 4μl、4×dNTP 1μl、上游引物P1 0.5μl、下游引物P2 0.5μl、超纯水 33μl快速离心混匀；95℃ 5min，冰浴冷却，然后快速离心使蒸汽沉于管底。加入1μl(1U/μl) Taq DNA聚合酶，快速离心混匀，加入30μl液体石蜡。

    循环条件：94℃1min；58℃ 1min；72℃ 1min；共35个循环，最后72℃延长7min。④电泳鉴定：将凝胶电泳图像输入美国Kodak凝胶分析系统，应用1 D Image Analysis Software进行表达强度分析，按下列公式相对灰度值。 相对灰度值= TGF-β（或Smad4）表达强度/β-actin表达强度。

    1.4　统计学处理　用SPSS11.0 for windows统计软件，采用Pearson χ2检验和t检验，Smad4和TGFβ间相关性采用Mantel-Haenszel χ2检验，α=0.05。

    2　结果

    2.1　TGF-βmRNA和Smad4 mRNA在正常胃黏膜和胃癌组织中的表达　TGF-β在39例正常胃黏膜组织中7例表达阳性，阳性率为15.42%；61例胃癌组织中42例表达阳性，阳性率为68.85%；两组间差异有显著性意义比较，P＜0.01（χ2=24.67）。正常胃黏膜组织中TGF-βmRNA的相对灰度值为0.95±0.31，胃癌组织中TGF-βmRNA的相对灰度值为1.14±0.38，两组比较，P＜0.01（t=3.83）。Smad4在39例正常胃黏膜组织中31例表达阳性，阳性率为79.41%；61例胃癌组织中29例表达阳性，阳性率为47.54%；两组间差异有统计学意义（χ2=10.12,P＜0.01）。正常胃黏膜组织中Smad4mRNA的相对灰度值为1.13±0.41，胃癌组织中Smad4mRNA的相对灰度值为0.94±0.33，两组比较,P＜0.05（t=2.49）。详见图1、2。

    2.2　TGF-βmRNA和Smad4mRNA与胃癌临床病理特征的关系　TGF-β、Smad44的表达与胃癌患者的年龄、性别及肿瘤部位、大小无关（P均＞0.05），与胃癌组织的分化程度、浸润深度、淋巴转移和TNM分期有关（P均＜0.05）。TGF-β在胃癌组织分化程度高、浸润深度浅、无淋巴转移和TNMⅠ、Ⅱ期的患者中阳性表达率高， Smad4在胃癌组织分化程度高、浸润深度浅、无淋巴转移和TNMⅠ、Ⅱ期的患者中阳性表达率低。见表1与图3、4。

    2.3　胃癌组织中TGF-β和Smad4表达之间的关系在61例胃癌患者中有12例同时TGF-β、Smad4表达阳性，2例同时TGF-β、Smad4表达阴性，TGF-β表达和Smad4表达间呈负相关（Mantel-Haenszel χ2=17.09，P<0.05）。详见表2，图5。

    3　讨论

    TGF-β是一类具有多种生物学功能的多肽类生长因子超家族具有多样生物学作用，它能够调节细胞增殖,分化,形态形成及刺激细胞外基质分泌,抑制免疫反应。TGF-β在体外的细胞学研究中发挥抑癌作用，在体内其生物学作用具有复杂性。在肿瘤的早期阶段，TGF-β抑制肿瘤的发生，在肿瘤的进展过程中，TGF-β的活性消失，TGF-β由肿瘤组织自分泌或旁分泌方式产生，失去抑制肿瘤的作用，升高的TGF-β使肿瘤细胞免疫逃避，肿瘤细胞增殖加快。我们的研究结果显示，TGF-β的阳性率在正常胃黏膜组中为15.42%，在胃癌组织中为68.85%。胃癌组织中的TGF-β表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴转移和TNM分期有关。TGF-β在胃癌组织分化程度高、浸润深度浅、无淋巴转移和TNMⅠ、Ⅱ期的患者中阳性表达率高。在本研究中，中高分化胃癌组的TGF-β阳性率为54.54%，低分化组为85.71%。Ura等［1］的研究支持上述数据。另外他还认为胃癌细胞产生的TGF-β能刺激成纤维母细胞增殖,而使胃壁僵硬,形成所谓的“皮革胃”，即BorrmannⅣ型胃癌。本文中BorrmannⅣ型胃癌的TGF-β阳性率为91.67%（11/12），BorrmannⅠ、Ⅱ、Ⅲ型胃癌的TGF-β阳性率为63.26%（31/49）（χ2=3.626，P=0.057），可能和样本数量不够大有关。Choi等［2］发现TGF-β与胃癌浸润深度、胃癌组织中增加的微血管计数正相关,同时,胃癌组织中微血管计数又与其侵袭力和淋巴结转移密切相关。这提示TGF-β可能通过促进胃癌间质中血管生长而促进癌细胞转移。本研究的结果也显示TGF-β阳性率与体现胃癌侵袭力的三项指标：浸润深度、淋巴转移、TNM有关,侵袭力强的胃癌组织中TGF-β阳性率高。

    Smad4 基因由2680 个碱基组成,编码由552 个氨基酸组成的蛋白质,包含11 个外显子和10 个内显子, 其cDNA 全长1656 个碱基。Smad4作为肿瘤抑制基因,最初是在40 %～50 %的胰腺癌中发现有缺失和突变。近期的研究发现Smad4基因在消化道有较高的组织特异性。虽然Niskizuka［4］的研究认为胃癌中根本不发生Smad4基因的缺失或突变，但更多的学者认为Smad4基因在胃癌中有明显的表达缺失［5］。本研究中，胃癌组织中Smad4表达阳性率明显低于正常胃黏膜，胃癌组织中Smad4的表达与组织分化程度、肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移、临床分期有关。胃癌组织分化程度高，肿瘤＜5cm，浸润浅，无淋巴转移，TNM分期早的肿瘤Smad4阳性率高。以上结果表明，抑癌基因Smad4 在早期胃癌中很少发生突变，Smad4基因的缺失或突变发生在肿瘤进展的后期,属于晚期分子事件。

    Smad4是TGF-β的信号从胞质传导到细胞核内的中介分子,在TGF-β诱导基因表达调控和随后的生长抑制中是必不可少的关键转录因子。本研究还显示在胃癌组织中, TGF-β阳性组Smad4mRNA的阳性率明显低于TGF-β阴性组的Smad4mRNA的阳性率,提示二者可能共同调节胃癌的发生、和生物学行为。

【】
  [1] Ura H, Obara T, Yokota K, et al. Effects of transforming growth factor-beta released from gastric carcinoma cells on the contraction of collagen-matrix gels containing fibroblasts[J]. Cancer Res, 1991，51(13):3550-3554.

[2] Choi YH， Choi KC， Park YE， et al. Relationship of transforming growth factor beta 1 to angiogenesis in gastric carcinoma[J]. J Korean Med Sci, 1997, 12(5):427-432.

[3] Hahn SA, Schutte M, Hoque ATMS, et al. DPC4, a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1[J]. Science, 1996, 271(5247):350-353.

[4] Nishizuka S, Tamura G, Macsawa C, et al. Analysis of the DPC4 gene in gastric carcinoma[J]. Jpn J Cancer Res, 1997, 88（4）:335-339.

[5] Xiang MC, Natsugoe S, Takao S, et al. Preserved Smad4 expression in the transforming growth factor beta signaling pathway is a favorable prognostic factor in patients with advanced gastric cancer[J]. Clin Cancer Res, 2001, 7(2):277-282.