Survivin反义核酸治疗人大肠癌裸鼠皮下种植瘤的实验研究宫向前

            作者：乔广东 李玉华 邢建华 寿楠海 丁印鲁  

【摘要】目的：探讨Survivin反义寡核苷酸对裸鼠人大肠癌皮下种植瘤体生长的抑制作用及其机制。方法：接种人大肠癌细胞制作裸鼠皮下大肠癌种植瘤模型，分别用Survivin反义寡核苷酸、正义核苷酸和生理盐水对皮下瘤体内直接进行注射，检测肿瘤的生长状况、瘤体体积及瘤重变化，抑制率。病理切片免疫组化检测瘤体ECD表达。结果：经Survivin硫代反义寡核苷酸治疗组裸鼠皮下移植瘤生长受到抑制，肿瘤重量明显小于对照组，肿瘤体积明显小于对照组和正义组（P＜0.05），裸鼠皮下移植瘤ECD表达增强。结论：Survivin反义核酸可以抑制大肠癌裸鼠移植瘤的生长，Survivin反义核酸抑制大肠癌裸鼠移植瘤生长的机理可能与ECD基因表达变化有关。

    【关键词】寡核苷酸类，反义・基因，Survivin・结直肠肿瘤・小鼠，裸

        【ABSTRACT】Objective:To study the inhibitory effect of survivin antisense oligodeoxynucleotides on growth of human colorectal carcinoma in nude mice.Methods:Human colorectal carcinoma transplanted subcutaneously in nude mice model was estabished.A total of 24 mice were divided into three groups,namely control group,survivinSODN group and survivinASODN group.Different treatments were given respectively,continuous infusions over 16 days.The weight and volume of the subcutaneous tumors was measured,and the morphology of tumor was observed.The expression of Ecadherin was examined immunohistochemically in the human colorectal cancer transplanted subcutaneously in nude mice.Results:The growth inhibitory rate was 57%in ASODN group,while only 6.67% was in SODN group.The weight and volume of the subcutaneous tumors in survivinASODN group is smaller than in control group.And the expression of Ecadherin is stonger in the ASDON group than in control group.Conclusion:Survivin antisense oligodeoxynucleotides are powerful of inhibiting the growth of human colorectal carcinoma in nude mice.The change of Ecadherin,another tumorrelated gene,may play an important role in this progress.

    【KEY WORDS】Oligodeoxynucleotides antisense・Genes,survivin・Colorectal neoplasms・Mice,node    研究表明，肿瘤的发生与基因缺失、突变或异常表达有关，因此基因疗法为肿瘤治疗提供了新的途径［1］。我们以Survivin基因为靶基因，探讨了其反义寡核苷酸对裸鼠人大肠癌生长的抑制作用及机制。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养  HT29结肠腺癌细胞株为中分化Ⅱ级上皮样细胞。于含10%小牛血清的RPMI1640培养液（PH7.27.4,Gibico,U.S.A)培养瓶中培养，内含青霉素和链霉素各100U/ml，单层培养于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中。0.25%胰蛋白酶消化，传代后处于指数生长期备用。实验用细胞经0.4%台盼蓝染色，拒染率＞95%。

    1.2  核苷酸链的人工合成  设计反义寡脱氧寡核苷酸链（ASODN），所有序列经同源性序列检测未发现与人类其他基因同源。其序列如下：5’GGCAACGTCGGGGCACCCAT3’，正义寡脱氧核苷酸（SODN）作为对照，其序列如下：5’GCCATCGTAGGGGATCGCTT3’。以上寡脱氧核苷酸序列由上海生工生物工程有限公司合成，均为硫代磷酸型。冻干分装并保存-20℃冰箱中。

    1.3  裸鼠大肠癌模型的建立  BALC/C，nu/nu裸小鼠，5~6周龄，雌性，体重19~22g，购于医学院实验动物繁育厂，饲养于SPF级无菌饲养室。HT29大肠癌细胞经细胞培养处于指数生长期。消化、吹打细胞，制成单细胞悬液，将单细胞液调整为细胞浓度为2.5×107/ml，每只裸鼠接种0.2ml单细胞悬液于一侧背部皮下。以皮下结节直径超过0.5cm为成瘤标准，2周左右成瘤，成瘤率为100%(24/24)。

    1.4  反义核酸抑制种植瘤试验  取种植成瘤后的裸鼠24只，称重量后根据体重随机分成3组，每组8只，分组及治疗情况如下：反义核苷酸治疗（ASODN组）每日于瘤体内多点注射Survivin ASODN,100μg/只。正常组（SODN组）和对照组：分别同法注射SurvivinSODN 100μg/只和200μl/只的生理盐水。SODN与ASODN体积均为0.2ml。

    1.5  肿瘤生长抑制率  治疗后每天观察裸鼠接种点有无破溃红肿及种植瘤的生长情况，用游标卡尺测量肿瘤长轴（a）、短轴（b），根据公式V=1/2ab2计算肿瘤体积，并观察裸鼠体重变化。于治疗后17d断颈处死裸鼠，取出肿瘤 ，称重后部分瘤组织于-70℃保存，部分肿瘤组织用福尔马林固定，连续4μm切片，免疫组化染色，光镜下观察。肿瘤生长抑制率计算公式为：抑制率=（1-治疗组瘤重量/对照组瘤重量）×100%。

    1.6  ECadherin基因蛋白表达的检测  采用SABC法。选择每张切片组织和细胞形态保存完整的组织区域进行免疫染色判断，组织或细胞破损的区域不予判定。ECadherin染色结果阳性细胞达到计数细胞的50%以上的标本定为阳性，阳性细胞＜50%或染色强度弱或无表达的标本定为阴性。结果由3位病理科医师独立作出判定综合而成。

    1.7  统计分析  两组资料间同一因素相关性分析用χ2检验或确切概率计算法。两样本均数差别用t检验。

    2  结  果

    2.1  一般情况  全部实验成瘤裸鼠均成活，于接种细胞后2周左右形成单一皮下种植瘤，成瘤率100%，接种点无红肿破溃。

    2.2  Survivin硫代反义寡核苷酸对裸鼠皮下种植瘤的生长的影响  经过瘤体内注射Survivin反义寡核苷酸的裸鼠，其肿瘤明显小于对照组和正义组。ASODN组与对照组第4、8天肿瘤体积有变化，但不明显，至第12、16天，差别较明显（P＜0.05）。试验后16天处死试验裸鼠，处死后取肿瘤称重量。对照组、SODN组、ASODN组的平均瘤重分别为（1.37±0.15）g、（1.28±0.17）g、（0.58±0.14）g，ASODN组与对照组差异有统计学意义（P＜0.01），SODN与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。ASODN组抑瘤率为57.7%。显著高于SODN组的6.7%。处死裸鼠后取瘤体观察大体标本，对照组和SODN组肿瘤体积大，血液供丰富，质地较脆，浸润周围皮肤和皮下组织，界限不清，不易分离，分离时易出血，切面呈鱼肉样；而ASODN组肿瘤体积较小。血供欠丰富，与周围组织浸润轻，容易分离，切面呈灰白色，3例见液化坏死区。

    2.3  ECadherin基因表达  ECadherin蛋白表达于细胞浆/膜上，棕黄、淡黄或黄色。阳性染色对照组和SODN组都为2例，ASODN组为7例（P＜0.05）。见图1、2。

    3  讨  论

    Survivin是1997年Altieri报道的一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族新成员［2，3］。作为凋亡抑制蛋白，Survivin与肿瘤的发生及临床特性有关，可作为肿瘤治疗的特异性靶点。

    反义核酸技术是根据核酸杂交原理设计，选择性抑制特定基因表达为目的的生物新技术［4］。我们试验结果表明，Survivin正义寡核苷酸对裸鼠皮下大肠癌移植瘤无抑制作用，而反义寡核苷酸可以抑制肿瘤生长，导致肿瘤负荷减轻，标本可见瘤体坏死灶，起到治疗肿瘤的作用。反义寡核苷酸作用原理基于碱基配对规则，可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控，这可能是反义Survivin寡核苷酸治疗裸鼠大肠癌移植瘤的重要作用机制。

    药代动力学研究表明，静脉内给药大量滞留于肝脏细胞内，在一定程度上限制了被滞留药物的生物可利用度，因此我们给予肿瘤局部注射方式。由于ASODN的药代效应较快，硫代寡核苷酸血浆分布半衰期小于1h，清除半衰期为40~60h。我们给予连续用药，以保证瘤体周围或瘤体内足够的治疗浓度和持续时间，并证明是有效的［5］。肿瘤的发生发展是多基因、多因素共同作用的结果。在不同的发展阶段不同的癌基因或抑癌基因的数目种类作用方式各不相同，因此针对单一基因治疗的反义寡核苷酸不能起到完全抑制肿瘤细胞生长的目的。另外可能的外在原因还有用药剂量不足，治疗时间不足，疗程较短等。

    为探求Survivin基因反义核酸治疗肿瘤的机理，我们应用免疫组化染色技术进一步研究了瘤体内细胞黏附分子ECD的蛋白表达。细胞粘附分子在细胞分化、游走和归位、形态发生、免疫等方面有重要作用［6］。ECadherin是钙离子依赖的细胞粘附分子，广泛存在于各种组织中的跨膜蛋白［7］，与细胞分化程度和肿瘤细胞的浸润性有关。本研究发现，经过Survivin反义寡核苷酸治疗后的瘤体ECD表达阳性率增高。ECadherin具有细胞粘附作用。与肿瘤的浸润、侵袭型有关，表达增高后可能抑制肿瘤的浸润扩散，使瘤体细胞更加黏附，抑制肿瘤生长从而瘤体体积减小，提示Survivin反义寡核苷酸除了通过直接促进肿瘤凋亡减轻肿瘤负荷，还可以通过体内其他基因相互作用变化等途径来影响肿瘤病情变化和进展。ECadherin分布于胚胎组织和成年组织上皮细胞，而裸鼠大肠癌移植瘤体为细胞株皮下种植所形成，因此，尚不清楚治疗过程中ECD阳性率增高是因为反义核酸治疗后所致，抑或肿瘤恶性表型变化后的表现，但这些现象验证了肿瘤的发生发展是多基因多因素共同作用的论断。

    参  考  文  献

    ［1］孙爱华，刘贤锡.大肠癌肝转移基因治疗研究进展［J］.普通外科进展，2004，7（1）：1.

    ［2］Ambrosisi G,Adida C,Altieri DC,A novel antiapoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma［J］.Nature Med,1997,3(8):917921.

    ［3］刘丰，傅仲学，宋炯.Survivin的表达与直肠癌细胞凋亡、血管形成及预后的关系［J］.中国现代普通外科进展，2004，7（3）：162.

    ［4］Izant J,Weintraub HH.Inhibition of thymidine kinase gene expression by antisense RNA:A molecular approach to genetic analysis［J］.Cell,1984,36:1007.

    ［5］Agrawal S,Iyer RP.Perspectives in antisense therapeutics［J］.Pharmacol Ther,1997,76(13):151160.

    ［6］Albelda SM,Buck CA.Integrin and other cell adhesion molecules［J］.FASEB,1990,4:2868.

    ［7］Nose A,Shimoyoma Y,Brackenbury R,et al.Expressed Recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems［J］.Cell,1988,54:9931001.