脂氧合酶抑制剂NDGA对HT

            作者：夏光涛 张源潮 武森森 张尚忠

  【摘要】目的：探讨脂氧合酶抑制剂NDGA在体外对结肠癌HT29细胞株生长抑制、凋亡影响。方法：应用MTT法绘制生长曲线；倒置相差显微镜观察细胞形态变化；扫描电镜观察细胞的超微结构变化，检测凋亡小体；流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期变化。结果：不同浓度NDGA处理HT29结肠癌细胞，随着药物浓度加大，细胞形态变圆，体积缩小，从瓶壁上逐步脱落，肿瘤细胞凋亡率逐步上升，癌细胞阻滞于G0／G1期。应用扫描电镜可见凋亡小体形成。结论：NDGA对结肠癌HT29细胞具有抑制生长、诱导凋亡作用，凋亡率随药物浓度加大逐步升高。具有剂量依赖效应。

    【关键词】脂氧合酶抑制剂・结直肠肿瘤・凋亡

     Research on apoptosis of colon cancer cell line HT29 induced by NDGA

     【ABSTRACT】Objective:To find out the effect of NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid),the lipoxygenase inhibitor,on colon cancer cell line HT29 in vitro from the aspects of cell growth inhibition, cell apoptosis.Methods:We applied respectively.① MTT to draw the growth curve.② inverted phase contrast microscope to observe morphologic change of cells as well as scanning electron microscope to observe changes of cell’s ultramicrostructure and apoptotic body.③ flow cytometry to examine the apoptosis and periodic changes of cells.Results:We used different concentration of NDGA to dispose cancer cell independently.Accompanying the rise in drug’s concentration,apoptosis rate of cells rose gradually,morphologic of cells became round,the volume became small and they abscised from the inner surface of the bottle.apoptotic body could be found through scanning electron microscope.The growth of cells was blocked in the stage of G0/G1.Conclusions:NDGA can inhibit colon cancer cell line HT29 growth and induce its apoptosis,the rate of which rises following the increase of drug concentration and displays the relying effect of doses.The drug blocks the cell in the stage of G0/G1.

    【KEY WORDS】Lipoxygenase inhibitors・Colorectal neoplasms・ Apoptosis    花生四烯酸的代谢分为环氧化酶（COX）和脂氧合酶（LOX）两个途径。COX是环氧化酶途径的关键酶。抑制COX活性能够诱导结肠癌细胞凋亡，抑制癌细胞转移，对此国内外学者已达成共识，抑制LOX途径能否抑制结肠癌细胞生长、诱导凋亡，目前国内外鲜有报道。本文应用NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid)处理HT29结肠癌细胞株，研究是否可抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡为临床提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  仪器及设备  37℃CO2恒温培养箱（NV2500E。美国），超净工作台（YJ－1450S，苏州），倒置相差显微镜（Olympus，日本），普通光学显微镜（ Olympus，日本BH2），台式高速离心机（HERMLEZK380），酶联免疫检测仪（BIORAD450型），流式细胞仪（ FACScan型，美国BD公司），JSMT300扫描电镜（日本JEOL公司）以及其他培养细胞常用设备。

    1.2  材料和试剂

    1.2.1  结肠癌细胞株  HT29细胞株购自山东省医学院肿瘤生物治疗中心。

    1.2.2  主要试剂  RPMI1640培养液和胰蛋白酶购自Gibco公司。新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。NDGA购自Calbiochem公司，四氮唑盐（MTT）购自Sigma公司，碘化丙啶（PI）购自北京岳泰生物制品公司。

    1.3   细胞培养  常规培养HT29结肠癌细胞。采用处于指数生长期的细胞进行实验，分别加入不同浓度的药物处理后，继续在CO2恒温箱孵育相应的时间后，进行有关指标检测。

    1.4  细胞形态学观察

    1.4.1  倒置显微镜观察  细胞传代后，每隔6h分别应用高倍镜及低倍镜观察一次HT29结肠癌细胞的形态学变化，细胞生长情况，培养液的情况。贴壁后，每隔4h观察1次。药物处理后每隔2h观察1次细胞生长情况，形态学变化。

    1.4.2  扫描电镜观察  应用NDGA（终浓度100μmol/L）处理48h。取出对照组及加药组长有癌细胞的载玻片，经3％戊二醛前固定，再应用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗3次，1％四氧化锇（锇酸）固定1h，再用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，乙醇梯度脱水，醋酸异戊脂置换，CO2临界点干燥、粘托、镀金，JSMT300扫描电镜15KV加速电压观察，拍照。

    1.5  癌细胞凋亡检测

    1.5.1  MTT法绘制生长曲线  实验设计为5组：空白组（不加细胞）、对照组（加入PBS液）、NDGA组（分别为1，10，100μmol/L），每组设5个平行孔。将培养瓶中贴壁的结肠癌HT29细胞应用0.25％的胰酶消化，细胞形态发生改变时，加入含有小牛血清培养液中和，吹打，制成细胞悬液，以104／ml的浓度接种于96孔培养板，每孔接种200μl。培养24h后，分别加入不同浓度药物，分别继续培养24，48，72h后取出一块培养板检测细胞光密度（OD）。实验方法：每孔加入新鲜配制的MTT液（5mg/ml）20μl，37℃，继续培养4h，小心吸去孔内培养上清液，每孔加入DMS0150μL，放置振荡器10min，使结晶物充分溶解，然后在酶联免疫检测仪上应用双波长(490,570nm)测光密度值，以空白组OD值调零。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制生长曲线。

    1.5.2  流式细胞仪检测癌细胞凋亡率及细胞周期变化  分别收集对照组及NDGA药物（100μmol/L）作用48h的HT29结肠癌细胞。先用0.25％的胰酶消化，再用含小牛血清培养液中和，然后再加入离心管中离心，用PBS液漂洗后再离心5min（1000r/min），加入70％的冷乙醇固定，4℃冰箱保存过夜。以PBS液漂洗后以100目筛网过滤，再离心5min（1500r/min）。加入PI工作液0.05ml，室温避光30min，上机检测。上机前以标准荧光微球体调整仪器的变异系数并稳定在2％以内。上机后收集2万个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存软盘，测试完后在Macintosh650机上用Modifit软件（Becton Dickinson公司提供）分析数据，由HP1200c／PS打印结果。

    1.6  统计学处理  定量资料数据均以x±s表示，统计计算采用SPSS12.0统计软件进行处理，进行方差分析、t检验、Dunnett t检验以及其他统计处理，P＜0.05为有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  NDGA作用HT29结肠癌细胞时细胞形态学观察

    2.1.1  倒置显微镜进行细胞形态学观察对照组HT29结肠癌细胞呈类圆形，部分伸展的癌细胞可呈现梭形，以贴壁方式生长。经过NDGA（100μmol/L)作用24h以后，细胞开始发生形态变化，表现为细胞较前变圆，体积缩小，细胞内颗粒、空泡增多，细胞粘附性降低，有较多细胞从瓶壁脱落，悬浮于培养液中（图1B）。随药物浓度增大，时间延长，这种变化越来越明显。

    2.1.2扫描电镜对细胞超微结构观察  对照组HT29结肠癌细胞呈贴壁生长，呈类圆形，部分癌细胞伸展为梭形，细胞饱满，表面有丰富微绒毛，癌细胞之间连结紧密，表面微绒毛之间相互交叉，经过NDGA（100μmol/L)作用48h癌细胞形成相互分隔的芽状突起，形成凋亡小体（图2B）

      2.2  NDGA对HT29结肠癌细胞诱导凋亡作用

    2.2.1  NDG4对HT29结肠癌细胞生长曲线的影响  对照组HT29结肠癌细胞生长迅速，1～100μmol/L浓度的NDGA对HT29结肠癌细胞生长均有抑制作用。1μmol/L药物作用组各个时间段分别与对照组相比，虽然OD值有下降趋势，但与对照组相比，差异没有统计学意义（P＞0.05)。随着NDGA药物浓度的增大（10，100μmol/L），OD值分别与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中100μmol/L的NDGA作用组OD值与对照组差异显著(P＜0.01)，说明HT29结肠癌细胞受抑制的程度随药物浓度的升高而增强（见表1，图3）。 表1  NDGA对结肠癌细胞株HT29 OD值的影响

    2.2.2  HT29结肠癌细胞凋亡率和细胞周期变化  对照组HT29结肠癌细胞在G0／G1前存在凋亡峰，凋亡率百分数为1.28±1.07，经过NDGA（100μmol/L）作用48h后，凋亡峰明显升高，凋亡率百分数为10.57±3.09，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）.G0／G1期的细胞比例增加。S期细胞比例下降，与对照组两期差异显著(P＜0.01)。而G2／M期NDGA作用组与对照组相比差异没有统计学意义(P＞0.05)。说明经NDGA作用后结肠癌HT29细胞凋亡率增加，NDGA可使HT29结肠癌细胞阻滞于G0／G1期，从而抑制HT29结肠癌细胞生长（表2，图4）表2  NDGA对HT29细胞凋亡率和细胞周期的影响

    3  讨  论

    花生四烯酸（AA）代谢分为环氧化酶（COX）和脂氧合酶（LOX）两个途径。研究发现，相对于正常组织，睾丸癌、乳腺癌、结肠癌及肺癌肿瘤组织中LOX代谢水平明显升高，提示肿瘤的发生可能与花生四烯酸经LOX途径代谢有关［1，2，3］。花生四烯酸经脂氧合酶途径进行生化代谢，产生白三烯（leukotrience,LT)及HETE(hydroxyeicosatetraenoic)。LOX又可分为5LOX，12LOX及15LOX3种亚型，不同类别的肿瘤细胞表达不同亚型，本实验选用的NDGA对上述3种亚型酶均有抑制作用［4］

    国外实验已证实结肠癌细胞株HT29具有合成LT的能力，表明该肿瘤细胞中存在LOX代谢途径，提示该细胞中有脂氧合酶抑制剂作用位点。对于LOX相关肿瘤的，主要有两个途径，一个途径是直接应用LT受体拮抗剂，有学者应用SC41930，LTB4拮抗剂用用于结肠癌细胞，发现能够抑制其生长。另一个途径为抑制LOX活性。两者相比较而言，应用LOX抑制剂作用比较直接，可以直接抑制LT的合成，从而诱导肿瘤细胞凋亡，降低其转移能力［2］细胞培养后应用NDGA处理HT29结肠癌细胞，研究其诱导凋亡的作用，报道甚少。

    肿瘤细胞发生凋亡的同时，细胞生长周期可发生变化。研究发现，在肿瘤的凋亡的过程中，肿瘤细胞可阻滞在G0／G1期［5，6，7］，与本实验结果基本相符。本实验从细胞形态、超微结构、细胞生长曲线，凋亡率及细胞周期变化等多个方面证实NDGA能够抑制HT29结肠癌细胞生长，诱导凋亡，而且这种作用随着药物浓度的升高而加强，具有剂量依赖效应，为LOX在临床上应用提供了实验依据。

    参  考  文  献

    ［1］Yoshimura R,Matsuyama M,Mitsuhashi M,et al.Relationship between lipoxygenase and human testicular cancer［J］.Int J Mol Med,2004,13（3）：389393.

    ［2］Vernon E Stele,Cathy A Holmes,Ernest T et al.Lipoxygenase:inhibitors as potential cancer chemopreventives［J］.Cancer Epidemiol Bioma Prev，1999,5（8）：467483.

    ［3］刘焕涛，孙靖中，唐鲁兵.脂氧合酶抑制剂NDGA对乳腺癌MCF7细胞端粒酶和bcl2的影响［J］.普通外科进展，2005，8(6)：358.

    ［4］Hong SH,Avis I,Vos MD ,et al.Relationship of arachidonic acid metabolizing enzyme expression in epithelial cancer cell lines to the growth effect of selective biochemical inhibitors［J］.Cancer Res，1999,59(9):22232238.

    ［5］刘先军，彭吉霞，吴清明，等.顺铂对食管癌细胞周期及端粒酶活性的影响［J］.胃肠病学和肝脏病学杂志，2003，12(2)：181182.

    ［6］周浩，陈智超，伍晓菲，等.三氧化二砷对慢性髓系白血病细胞周期的影响［J］.临床血液病杂志,2003,16（3）:127129.

    ［7］符德元，范萍，王水.三苯氧胺与阿霉素联合应用对乳腺癌MCF7细胞生长与凋亡的影响［J］.南京医科大学学报,2003，23（2）：134137.