PTEN与基质金属蛋白酶在胃癌组织中的表达及意义

          作者：朱宝和 詹文华 刘弋 马晋平 李正荣

【摘要】目的：探讨PTEN与基质金属蛋白酶（MMP）在胃癌组织中的表达、相互关系及意义。方法：应用免疫组化SP技术检测80例胃癌组织中PTEN、MMP2和MMP9表达，同时检测20例正常对照组胃粘膜中PTEN表达。结果：胃癌组织中PTEN高表达率35/80（43.8%）显著低于对照组20/20（100.0%）（P＜0.01）；PTEN表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移和肿瘤分期显著相关；胃癌组织中MMP2、MMP9阳性表达率分别为41/80（51.3%）、29/80（36.3%），与胃癌浸润深度、淋巴结转移和肿瘤分期显著相关；PTEN与MMP2、MMP9表达显著负相关，与病人预后相关，KaplanMeier生存曲线分析显示PTEN高表达者术后累计生存率显著高于低表达者，PTEN高表达者术后3年、5年生存率显著高于低表达者；MMP2、MMP9阳性表达者术后累计生存率显著低于阴性表达者，MMP2、MMP9阳性表达者术后3年、5年生存率显著低于阴性表达者。结论：胃癌组织中PTEN表达显著减少，PTEN与MMP2、MMP9表达显著负相关，PTEN可能通过调控胃癌组织MMP2、MMP9表达，抑制胃癌的浸润和转移，影响病人的预后。

    【关键词】胃肿瘤・PTEN・基质金属蛋白酶

     Expression of PTEN and matrix metalloproteinase and their clinicopathologic and prognostic significance in human gastric carcinoma

     【ABSTRACT】Objective:To investigate expression of PTEN,MMP2 and MMP9 in human gastric carcinoma,and to identify the relationship between expression of PTEN and that of MMP2 and MMP9 and their clinicopathologic and prognostic significance.Methods:Expression of PTEN,MMP2 and MMP9 was examined by SPmethod immunohistochemistry in 80 archival paraffinembedded gastric carcinoma tissue specimens,and expression of PTEN was also examined by SPmethod immunohistochemistry in 20 normal gastric tissue specimens for control.Results:Expression of PTEN in gastric carcinoma 35/80(43.8%) was significantly reduced than that in normal gastric tissues 19/20(95.0%).P＜0.01.Expression of PTEN significantly correlated with tumor differentiation,depth of tumor invasion,lymph node metastasis and tumor staging.Expression of MMP2 and MMP9 were 41/80(51.3%) and 29/80(36.3%)respectively.Expression of MMP2 and MMP9 significantly correlated with depth of tumor invasion,lymph node metastasis and tumor staging.Expression of PTEN negatively correlated with that of MMP2 and MMP9.Expression of PTEN,MMP2 and MMP9 significantly correlated with patients’prognosis.KaplanMeier survival curves showed that cum survival of patients with highly expression of PTEN was significantly higher than those with reduced expression.Logrank test,P＜0.05.But cum survival of patients with positively expression of MMP2 and MMP9 were significantly lower than those with negatively expression,Logrank test,P＜0.01.The 3,5year postoperative survival rates of patients with highly expression of PTEN were significantly higher than those with reduced expression,but that of patients with positively expression of MMP2 and MMP9 were significantly lower than those with negatively expression.Conclusion:Expression of PTEN in gastric carcinoma was significantly reduced than that in normal gastric tissues.Expression of PTEN significantly correlated with that of MMP2 and MMP9.PTEN could suppress tumor invasion and metastasis by means of regulating expression of MMP2 and MMP9,and could fairly serve as prognostic factors in gastric carcinoma.

    【KEY WORDS】Stomach neoplasms・Phosphatase and tension homology deleted on chromosome・Matrix metalloproteinases    PTEN（phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten）是第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，可通过多种途径抑制肿瘤的发生、、浸润和转移，影响肿瘤预后；基质金属蛋白酶（MMPs）与肿瘤生物学行为相关，促进胃癌的浸润和转移，但胃癌组织中PTEN与基质金属蛋白酶表达的关系还不清楚。本研究采用免疫组化技术检测胃癌组织中PTEN、MMP2和MMP9表达，探讨胃癌组织中PTEN与基质金属蛋白酶表达间的关系及临床意义。

    1  材料与方法

    1.1  材料  病例选自安徽医科大学第一附属普外科手术，术后随访超过5年的病例为胃癌组80例，男61例，女19例，年龄28~77岁，平均56岁。依据国际抗癌联盟（UICC）分期标准（第4版）Ⅰ、Ⅱ期肿瘤57例，Ⅲ、Ⅳ期23例，另选取20例同期经胃镜及病理诊断为正常胃粘膜组织作对照组。

    1.2  试剂和方法  兔抗人MMP2、MMP9多克隆抗体（浓缩型）购自博士德公司，工作滴度1∶200，鼠抗人PTEN单克隆抗体（即用型）、SP免疫组化试剂合购自迈新公司。全部标本甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片。采用免疫组化SP技术检测标本中PTEN、MMP2和MMP9表达，PTEN组采用高温、高压修复抗原，MMP2和MMP9组采用微波修复抗原。每批试验均设有阴性、阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，已知阴性切片作为阳性对照。

    1.3  阳性判断PTEN表达以胃腺上皮细胞或癌细胞胞浆中出现明显的黄色、棕黄色或黄褐色颗粒为阳性细胞，采用半定量积分法判断结果，阳性细胞≤5%为0分，6%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，＞75%为4分；染色强度按无着色、黄色、棕黄色、棕褐色分别为0、1、2、3分；两者积分相乘，0分为阴性（-），1~4分为弱阳性（+）5~8分中度阳性（++），9~12为强阳性（+++），（-）~（+）视为低表达，（++）~（+++）视为高表达。MMP2和MMP9以癌细胞胞浆中或胞膜上出现明显的黄色、棕黄色或黄褐色颗粒为阳性细胞，阳性细胞＜25%为阴性，≥25%为阳性。

    1.4  统计学分析  组间差异采用χ2检验，表达间的相关性采用Spearman等级相关分析，预后采用KaplanMeier生存曲线分析，同时采用Logrank检验，所有资料经SPSS12.0  for Windows统计软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义标准。

    2  结  果

    2.1  PTEN在两组中的表达  PTEN表达定位于胃腺上皮细胞或癌细胞胞浆中（见图1），胃癌组织中PTEN表达显著降低，胃癌PTEN高表达率35/80（43.8%），显著低于正常对照组20/20（100.0%）。见表1。表1  PTEN在胃癌组和对照组中的表达

　　2.2  胃癌组织中PTEN、MMP2和MMP9表达与临床病理特征的关系  PTEN表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移和肿瘤分期显著相关。随着肿瘤分化程度降低、浸润深度增高、淋巴结转移和肿瘤分期升高，PTEN表达显著降低，但与肿瘤大小无明显相关性。本组胃癌组织中MMP2、MMP9阳性表达率分别为：41/80(51.3%)，29/80（36.3%）定位于癌细胞胞浆或胞膜，细胞外间质中也有少量MMP2、MMP9表达（图2、3）。MMP2、MMP9表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和肿瘤分期显著相关，随着肿瘤浸润深度增加、淋巴结转移和肿瘤分期升高，MMP2、MMP9阳性表达率显著升高。见表2。

    2.3  胃癌组织中PTEN与MMP2、MMP9表达的关系  胃癌组织中PTEN与MMP2、MMP9表达显著负相关，随着胃癌的进展，胃癌组织中PTEN表达逐渐下降，MMP2、MMP9表达则明显升高。见表3。

    2.4  胃癌组织中PTEN、MMP2、MMP9表达与肿瘤预后的关系  KaplanMeier生存曲线分析显示胃癌组织中PTEN表达与病人预后显著正相关，PTEN高表在者术后累计生存率显著高于低表达者（Logrank检验，P＜0.05），见图4；高表达者术后3年、5年生存率分别为29/35（82.9%）、21/35(60.0%)，显著高于低表达者27/45（60.0%）、17/45(37.8%)。MMP2、MMP9表达与病人预后显著负相关，MMP2、MMP9阳性表达者术后累计生存率显著下降（Logrank检验，P＜0.01），见图5、6；阳性表达者术后3年、5年生存率分别为22/41（53.7%）、13/29(44.8%)和10/41(24.4%)、6/29(20.7%)，显著低于阴性表达者：34/39(87.2%)、43/51(84.3%)和28/39(71.8%)、32/51(62.7%)。表2  胃癌组织中PTEN、MMP2、MMP9表达与胃癌生物学行为的关系病理特征

    3  讨  论

    PTEN基因异常广泛存在于人类多种恶性肿瘤中，胃癌组织中也存在PTEN基因的突变缺失［1］和启动子的异常甲基化［2］，沿正常胃组织、肠化生、不典型增生和胃癌的癌变过程，PTEN表达逐渐降低［3］，说明PTEN参与了胃癌的发生、［4］。本组胃癌组织中PTEN高表达率为43.8%，显著低于正常胃组织100.0%。PTEN通过调控细胞的分化、增殖、凋亡等抑制胃癌的发生、发展，癌变过程中由于PTEN基因突变缺失［1］和/或启动子的异常甲基化［2］，导致胃癌组织中PTEN表达降低，甚至完全不表达，PTEN调控能力下降，导致胃癌的发生、发展。

    本组胃癌组织中PTEN表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移和肿瘤分期显著相关，但与肿瘤大小无关。PTEN主要通过诱导细胞周期阻滞，抑制细胞增殖，促进细胞分化，促进细胞结构和功能的完善，与它能诱导细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21、p27和p57表达［5，6］和抑制细胞周期素D1（cyclinD1）的积聚［7］有关。PTEN可以多途径地抑制肿瘤的浸润和转移，稳定和增强肿瘤细胞间的黏附，减少肿瘤细胞的分离和脱落；影响黏着斑复合体的形成及肌动蛋白细胞骨架的重构，抑制肿瘤细胞的迁移扩散；抑制肿瘤细胞非锚定依赖性生长及诱导失巢凋亡；还可以抑制细胞外基质降解和抑制肿瘤血管生成等，从而抑制肿瘤的浸润和转移［8］，其中抑制细胞外基质降解发挥了重要作用。

    本研究进一步证实MMP2、MMP9表达与胃癌的浸润、转移和肿瘤分期相关，影响病人预后。随着肿瘤的浸润和转移显著增加，MMP2、MMP9阳性表达率显著增加。MMP2、MMP9均为明胶酶类基质金属蛋白酶，主要作用是裂解Ⅳ型和Ⅴ型胶原。胶原是细胞外基质的主要组成部分，细胞外基质尤其是基底膜，是肿瘤浸润和转移过程必须克服的生理屏障，随着细胞外基质降解的增加，有利于肿瘤的浸润和转移。MMP2、MMP9还具有一定的促进肿瘤血管生成作用，血管外基质和基底膜的降解，有利于血管内皮细胞迁移，有利于血管出芽，促进肿瘤血管生成。同时，MMP2、MMP9还能促进一些生长因子如VEGF、bFGF、TGFβ等合成与释放，促进肿瘤血管生成作用。随着胃癌组织中MMP2、MMP9表达的增高，促进了肿瘤的浸润和转移。

    胃癌组织中PTEN与MMP2、MMP9表达显著负相关，随着PTEN表达降低，MMP2、MMP9阳性表达率逐渐增加。PTEN可在多水平上调控MMP2、MMP9表达，减少细胞外基质的降解，抑制肿瘤的浸润和转移。PTEN缺失的胶质瘤细胞中MMP2的水平和活性显著升高，浸润性增加，导入PTEN可以抑制MMP2基因启动子的活性，降低MMP2mRNA水平，在转录水平上降低MMP2的表达，减少MMP2的分泌，抑制MMP2酶的活性，减少细胞的浸润［9］。活化水平上的PTEN可以显著降低MT1MMP的表达，减少MT1MMP激活proMMP2成为活性的MMP2［10］，抑制MMP2的活性。PTEN还可以增加MMP2抑制物TIMP2的分泌［11］，TIMP2可与MMP2以1∶1形式形成复合物，抑制了MMP2的活性。PTEN也可以减少MMP9的分泌，降低MMP9的水平，同时增加MMP9抑制物TIMP1的分泌，TIMP1可与 MMP9以1∶1形式形成复合物，降低MMP9的活性［9］。本研究提示胃癌组织中PTEN可以调控MMP2、MMP9表达，但具体的调控机制有待于进一步研究。

    胃癌组织中PTEN、MMP2和MMP9表达显著影响病人术后生存期，KaplanMeier生存曲线分析显示胃癌组织中PTEN高表达者术后累计生存率显著高于低表达者，MMP2、MMP9阳性表达者术后累计生存率则显著低于阴性表达者，Logrank检验差异有显著性。PTEN高表达者术后3年、5年生存率显著高于低表达者，MMP2、MMP9阳性表达者术后3年、5年生存率显著低于阴性表达者。检测胃癌组织中PTEN、MMP2和MMP9表达，有利于预测病人的预后。

    胃癌的浸润和转移是一个多步骤、多阶段和多因素参与的复杂过程，PTEN可以多途径地抑制肿瘤的浸润和转移，其中，抑制细胞外基质降解和抑制肿瘤血管生成起着至关重要的作用。我们的研究提示PTEN可以通过抑制胃癌组织中MMP2、MMP9表达，从而抑制细胞外基质降解，抑制肿瘤的浸润和转移。随着胃癌组织中PTEN表达减少，PTEN抑制MMP2、MMP9表达及其活性的作用减弱，MMP2、MMP9表达增加，导致细胞外基质降解增加，促进肿瘤浸润和转移。初步结果说明在胃癌组织中三者形成一条信息传导通路，PTEN低表达和MMP2、MMP9高表达共同作用，促进胃癌的浸润和转移，影响病人预后。

　　参  考  文  献

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