直肠癌远侧端黏膜p53的表达及其意义

             作者：涂小煌　王为忠　王烈　黎成金　宋京翔　宋丽娜　赵春雷

【摘要】  目的: 从分子病水平上探讨直肠癌的安全远侧切缘。方法：对45例中低位直肠腺癌下缘进行标记，PET/CT检查结合半定量免疫组织化学方法对直肠癌的远侧端黏膜p53表达进行研究。结果：直肠癌及远侧端直肠黏膜均可见p53表达，直肠癌组织中p53表达明显高于远侧端的直肠黏膜组织。直肠癌远侧端黏膜p53表达随着距离增大而减少，但有显著性异常改变只在有限的长度内（远侧端1.5 cm），阴性对照中仍有p53的表达。肿瘤组织及直肠远侧端黏膜中p53表达与肿瘤大小、分期以及病理类型无关。结论：直肠腺癌远侧1.5 cm长度的组织, p53明显异常表达, 若从分子病理学角度来界定，2 cm的直肠远侧端长度是安全的远侧切缘。

【关键词】  直肠肿瘤 全直肠系膜切除术 p53 PET/CT

      Expression of p53 and its significance in rectal distal mucosa of rectal cancer

    【ABSTRACT】 Objective: To explore the required distal margin of radical surgery for rectal cancer in molecular pathologic level. Methods: Forty-five cases of rectal cancer were marked before operation，and then were detected by PET/CT imaging；p53 expression in rectal distal tissue portion were detected by immunohistochemical techniques. Results: p53 expression in rectal cancer was significantly higher than that in the mucosa distal to cancer. p53 expression was not significantly different between the mucosa more than 1.5 cm distal to the cancer and the mucosa of negative control rectal tissue. It was not associated with size and staging of rectal cancer. Conclusion:   Excision of 1.5 cm rectal mucosa distal to the cancer could remove obvious abnormity tissue of p53 expression.

    【KEY WORDS】 Rectal cancer· Total mesorectal excision · p53· PET/CT

    　　中低位直肠癌患者手术远侧端切除的长度决定了患者能否保肛手术的最重要的因素。由于直肠癌是否存在远侧端浸润，远侧端浸润的标准如何界定等问题仍有分歧，因此直肠癌安全远侧切缘一直存在争议。本研究采用免疫组织化学方法及半定量方法对中低位直肠腺癌远侧端黏膜的p53表达进行研究，旨在分子病理学水平上界定直肠癌的安全远侧切缘。

    1　资料与方法

    1.1　一般资料　2004年10月～2006年6月南京军区福州总肠镜检查及病理确诊为直肠中下段癌患者45例（已除去非全直肠系膜切除术患者），其中男26例，女19例，年龄28~78岁，中位年龄51岁。隆起型9例，溃疡型30例，浸润型6例。45例直肠癌均为腺癌，中高分化腺癌28例，低分化腺癌17例。Dukes病理分期： A期6例，B期27例，C期12例。肿瘤直径>3 cm  31例，肿瘤直径≤3 cm者14例。

    1.2　标本制作　肠道准备干净后行肛肠综合仪（ZZ-II 500型，杭州大力神医疗器械有限公司） 检查，记录肿瘤所在位置，于肿瘤下缘约0. 5 cm及1 cm处横向缝合两针，用深静脉导管剪成0.5~1 cm长的细管，穿入线内结扎，作为标记物。所有患者均行PET/CT全身显像检查，图像通过迭代法重建为横断/冠状断及矢状断层图像,每层厚度为1.25 mm。测量两标记线的距离。行直肠癌全直肠系膜切除（total mesorectal excision, TME）保肛手术［１］,切除肿瘤，解剖直肠系膜,观察肿瘤在肠壁及直肠系膜内的浸润情况。于肿瘤的对侧纵行切开直肠壁,轻轻牵拉标本两切端，使肿瘤下缘两标记线的距离与PET/CT上检测的距离一致（位置）。用大头钉固定后，分别取肿瘤上缘10 cm处、肿瘤中心、肿瘤下缘至0.5 cm、0.5～1 cm、1～1.5 cm、1.5～2.0 cm、2.0～2.5 cm处宽为0.5 cm的组织，肿瘤下缘各组织分别标记为a、b、c、d和e段,肿瘤中心组织作为阳性对照,肿瘤上缘10 cm处组织作为阴性对照。各组织4%甲醛固定、石蜡包埋、3 μm厚切片，行p53免疫组织化学染色。

    1.3　半定量测定　p53为鼠抗人单克隆抗体（即用型），免疫组化试剂盒（EliVisionTM plus广普试剂盒）均为Maixin.Bio公司产品。免疫组织化学PAP法进行染色，p53的阴性对照染色均采用PBS代替一抗，其余步骤均一致。p53蛋白呈棕色颗粒状或团块状分布在黏膜上皮细胞核，200倍光镜观察每张切片10个黏膜固有层区p53阳性表达，半定量评分。免疫组化阳性半定量评分标准：1）阳性产物显色强度评分为阴性0分，弱1分，中等2分，强3分；2）阳性产物分布范围评分标准：≤黏膜固有层总面积的25%为1分，26％~50%为2分，51％~75%为3分，＞75%为4分。该例标本的阳性积分=显色强度×分布范围。1.4　统计学分析　应用SPSS10.0软件进行统计分析，数据以x±s表示。各组数据间的比较用t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　直肠癌及远侧端黏膜组织的p53的表达　免疫组织化学染色显示，p53在直肠癌组织肿瘤细胞核分布较为均匀，p53阳性肿瘤细胞核大，核分裂像明显，且呈堆积存在，而远侧端黏膜及阴性对照黏膜的p53表达阳性细胞形态与正常细胞相似（图1）。直肠癌组织中p53表达明显高于直肠癌远侧端的黏膜组织；直肠癌远侧端黏膜p53表达随着距离增大而减少，但阴性对照中仍有p53的表达；直肠癌远侧端>1.5 cm的直肠黏膜，p53表达与阴性对照无显著性差异（表1）。

    2.2　直肠癌各病理类型的p53表达　直肠癌远侧端各段黏膜的p53表达与直肠癌的组织学类型差异无统计学意义（P＞0.05），即p53表达与直肠癌的分化程度无关（表2）。

    2.3　直肠癌各组织中p53表达与直肠癌大小之间的关系　>3 cm与≤3 cm的直肠癌组织以及直肠癌远侧端各段黏膜组织中p53表达差异无统计学意义（P＞0.05），即肿瘤组织以及远侧端各段黏膜组织中p53表达与肿瘤大小无关 （表2）。

    2．4　各病理分期直肠癌远侧端黏膜的p53的表达　直肠癌病理分期之间直肠癌肿瘤组织及其远侧端各段黏膜中p53表达差异无统计学意义（P＞0.05）。即直肠癌组织及其肿瘤远侧端黏膜组织中p53表达与病理分期无关 （表2）。

    3　讨论

    3.1　直肠癌的p53蛋白表达及其意义　p53基因是与人类恶性肿瘤关系最为密切的肿瘤抑制基因［２］,对细胞的生长起负性调节作用，分为野生型与突变型，前者为肿瘤的抑制基因，后者为致癌基因，前者的缺失突变或后者的过量表达均可促进肿瘤的发生。由于野生型p53蛋白产物半衰期短，含量低，因此用免疫组化法检测出的是存积而稳定的突变型p53蛋白，而突变型p53可使细胞过度生长的抑制丧失，从而在肿瘤的发生中发挥重要作用，所以p53蛋白阳性细胞中表达的p53蛋白具有致癌效应［３］。

    　　直肠癌组织中p53表达与肿瘤的生物学行为以及预后之间的关系报道不尽相同。有人认为肿瘤中p53的大量表达与肿瘤的分期、淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分化程度及预后有关［4］，而另外一些报道却相反［５］。本研究结果支持后者观点：肿瘤组织中p53表达与肿瘤大小、分期及病理类型无关。由于p53表达代表肿瘤发生的晚期事件, 绝大部分文献报道正常的胃肠道黏膜细胞不表达p53［2］。本研究结果显示肿瘤组织中p53确为高表达，而在直肠阴性对照中直肠黏膜也有p53的表达，这些细胞并无形态学上的异常，推测直肠癌患者正常的直肠黏膜有分子生物学异常的改变。本研究支持 Ngoi等［６］的观点，直肠癌组织外正常直肠黏膜分子生物学的改变是结直肠癌发生、发展中整体改变的反应，而不能认为这些细胞已发生了癌变。

    3.2　直肠癌癌旁组织p53蛋白表达　直肠癌癌旁组织中p53蛋白表达的异常，文献报道结果不一，可能与研究方法、长度测量误差有关，最准确的应以人体状态为标准进行测定。本研究采用术前直肠内标记，PET/CT检查，测量距离，术后标本按此距离复原，可以最大程度上减少长度测量上的误差。此外研究方法的不同也是造成结论不同的原因。目前大部分的p53表达采用定性研究的方法，因此很难观察到分布的连续性变化。本研究采用半定量的方法，发现癌旁组织虽然存在分子生物学分子的异常，但有显著性异常改变只在有限的长度内；而且癌旁组织中p53蛋白表达与肿瘤的分期、大小、以及病理类型无关。

    3．3　直肠癌远侧端切除长度的探讨　直肠癌远侧端切除长度目前有缩短的趋势，从上个世纪80年代5 cm至目前主张1 cm不等的标准［７］。如何界定直肠癌远侧端壁内浸润长度包括采用分子生物学检测方法或是组织学检测方法，国内外目前仍没有一致意见。有学者主张直肠远侧端切除的长度以镜下无肿瘤细胞残留为标准，由于直肠癌的远侧端转移少见，因此有学者认为远侧端切除长度1 cm即可［７］；国内研究认为应以3 cm为标准［８，９］。应该承认与传统组织病方法相比，分子生物学方法检测肿瘤标记物的敏感性较高，而且能检测分子水平上的异常，发现隐匿的癌细胞，即直肠远切缘常规病理切缘阴性的组织,仍可能有分子病理学方面的异常。行直肠癌根治切除时应尽可能以分子切缘无显著异常为标准, 本研究结果显示，直肠远侧端p53显著性异常表达在直肠远侧端的1.5 cm内，因此，从分子病理学角度衡量，切除直肠腺癌远侧端2 cm长度可完全切除明显分子病理学异常的组织。但在临床应用方面，由于许多分子生物学检查的指标意义不清，肿瘤发生、发展是多因素、多途径参与的过程，而分子病理学异常组织残留是否与直肠癌术后复发有关以及分子病理切缘与常规病理切缘之间的临床随机比较未有定论，因此，以分子病理学为标准的临床意义仍需进一步的研究。

【文献】
  [1] 涂小煌，王烈.直肠癌全直肠系膜切除术[M].福州，福建科技出版社,2006：122-130.

[2] Munro AJ，Lain S，Lane DP. p53 abnormalities and outcomes in colorectal cancer: a systematic review[J]. Br J Cancer, 2005,92（3）: 434-444.

[3] 林武华，孙念绪，刘同发.散发性结直肠癌微卫星不稳定性与Mt-p53及bcl-2蛋白表达的研究[J].消化外科，2002，1（1）：33-36.

[4] Lebe B, Sarioglu S, Sokmen S, et al. The clinical significance of p53, p21, and p27 expressions in rectal carcinoma[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2005, 13（1）: 38-44.

[5] Kawasaki Y, Monden T, Morimoto H, et al. Immunohistochemical study of P53 expression in microwave fixed, Paraffin-embedded sections of colorectal carcinoma and adenoma[J]. Am J Clin Pathol, 1992, 98（2）:244.

[6] Ngoi SS, Staiano-Coico L, Godwin TA, et al. Abnormal DNA ploidy and proliferative patterns in superficial colonic epithelium adjacent to colorectal cancer[J]. Cancer, 1990, 66（5）:953-959.

[7] Karanjia ND, Schache DJ, North WR, et al. ‘Close shave’ in anterior resection[J]. Br J Surg, 1990, 77（5）: 510-512.

[8] 潘志忠，万德森，张昌卿，等. 大切片P53免疫组化染色对判断直肠癌远端扩散长度的临床意义[J]. 癌症，2004, 23（10）：1199-1202.

[9] 邓海军，李国新，卿三华，等. 直肠癌远侧癌旁黏膜p53基因突变及其蛋白表达[J]. 实用癌症杂志，2003, 18（2）：170-172.