Survivin和p27kipl在胆囊癌组织中的表达及相关性研究
作者：张宗利 柴杰 马德民 高延超
【摘要】 目的：检测胆囊癌组织中Survivin和p27kipl的表达，研究二者与胆囊癌临床病理特征的关系，并探讨二者的相关性。方法：采用免疫组织化学技术检测50例胆囊癌、20例胆囊息肉、20例胆囊炎组织中Survivin和p27kipl表达。结果：50例胆囊癌组织中39例Survivin蛋白表达阳性，22例p27kipl蛋白表达阳性，二者表达呈负相关系；Survivin在胆囊息肉和胆囊炎组织中不表达，p27kipl在胆囊息肉和胆囊炎组织中呈高表达；Survivin在胆囊癌组织中的表达与患者性别、年龄、病理分级、Nevin分期和淋巴结转移无关（P＞0.05），p27kipl在胆囊癌组织中的表达与病理分级、Nevin分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），而与年龄、性别无明显相关性。结论：Survivin和p27kipl表达异常可能在胆囊癌的发生、中起重要作用，二者在胆囊癌的发生、发展中有相互作用；Survivin在胆囊癌组织中的高表达提示其可能与肿瘤的发生有关；p27kipl有可能成为判断胆囊癌预后的有效指标之一。
【关键词】 胆囊肿瘤·p27kipl·Survivin·免疫组织化学
Expression and implication of Survivin and its correlation with p27kipl in gallbladder cancer
【ABSTRACT】 Objective: To study the expression of Survivin and p27kipl and their relationship with the clinical features of gallbladder cancer. Methods: Fifty specimens of gallbladder cancer, 20 specimens of chronic cholecystitis, 20 specimens of polypoid lesions of gallbladder（PLG） were included, the expression of Survivin and p27kipl were detected using immunohistochemistry assay. Results: In 50 cases of gallbladder cancer, 39 cases expressed Survivin and 22 cases expressed p27kipl. There was a negative correlation between the expression of p27 and survivin （P<0. 05）, 13 cases of 39 Survivin-positive cases were p27kipl positive, but 9 cases of 11 Survivin-negative cases were p27kipl positive. Survivin was not detected in chronic cholecystitis and PLG, but p27kipl was positive in chronic cholecystitis and PLG. The expression of Survivin in gallbladder cancer had no association with the patients’ age and gender, the pathological grade, clinical stage and lymph node metastasis of gallbladder cancer（P＞0.05）, but the expression of p27kipl was related to the pathological grade, clinical stage and lymph node metastasis of gallbladder cancer （P＜0.05，it had no association with the patients’ age and gender. Conclusions: Survivin and p27kipl might play important roles in initiation and development of gallbladder carcinoma.
【KEY WORDS】 Gallbladder neoplasams·p27kipl·Survivin·Immunohistochemistry
原发性胆囊癌（primary gallbladder carcinoma, PGC）因早期无特定的临床症状和体征，诊断非常困难，且术后易复发或转移，预后极差。因此，研究胆囊癌高侵袭、高转移等恶性生物学行为的发生机制，对早期诊断和预后十分重要。本研究采用免疫组织化学法分别检测了Survivin和p27kipl在胆囊癌组织中的表达，探讨两者的相关性及与胆囊癌临床病理因素及预后的关系。
1 材料与方法
1.1 标本 来自山东大学齐鲁2000年2月～2006年8月收治的经手术根治切除且病理确诊的50例胆囊癌的蜡块，临床资料齐全。其中男26例，女24例。年龄33～74岁，中位年龄56.4岁。组织学分化:高分化13例，中分化17例，低分化20例。病理类型:乳头状腺癌27例，管状腺癌16例，粘液腺癌4例，鳞癌2例，印戒细胞癌1例。局部淋巴结转移:36例有转移，14例无转移。临床Nevin分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期9例，Ⅲ期12例，Ⅳ期19例，Ⅴ期8例，另取同期手术切除的20例胆囊息肉、20例胆囊炎标本作为对照。
1.2 试剂与方法 兔抗人Survivin多克隆抗体、鼠抗人p27单克隆抗体、SP免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（SP）法，按试剂盒说明进行操作，用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性的肿瘤标本作为阳性对照。
1.3 结果判断 p27kipl阳性表达定位于胞核/胞质，Survivin阳性表达定位于胞质/胞核。细胞核或细胞质内出现棕黄色颗粒判断为阳性细胞。采用双盲法，记数5个高倍镜视野，结果按阳性细胞所占比例分别记录，无明显阳性细胞为阴性（-），阳性细胞数＜10%为弱阳性（+），10%～49%为中等阳性（++），≥50%为强阳性（+++）。
1.4 统计学分析 采用SPSS10.0软件进行统计分析，χ2检验，α=0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1 胆囊癌、胆囊息肉和胆囊炎组织中Survivin、p27kipl的表达情况 Survivin和p27kipl阳性表达分别为胞质和胞核出现棕黄色颗粒（图1）。在20例胆囊息肉和20例胆囊炎标本中，p27kipl阳性分别为20例（100%）和18例（90%），而在胆囊息肉和胆囊炎标本中未检测到Survivin阳性表达。50例胆囊癌中，Survivin蛋白阳性为39例（78%），明显高于胆囊良性病变的阳性表达率；p27kipl蛋白阳性表达为22例（44%），阳性表达率低于胆囊良性病变，差异有统计学意义（P<0.01）。
２．2 Survivin和p27kipl蛋白表达与胆囊癌临床病理特征的关系 表1结果统计学分析显示，Survivin表达与胆囊癌患者性别、年龄、病理分级、Nevin分期和淋巴结转移等均无关，差异无统计学意义（P＞0.05）。50例胆囊癌中，高分化组p27kipl蛋白的表达的阳性率（76.9%）显著高于中、低分化组（47.1%，20%）（P<0.05）；胆囊癌Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期p27kipl蛋白的阳性率为63.6%，显著高于Ⅳ～Ⅴ期p27kipl蛋白的阳性率（29.6%，P<0.05）。无淋巴结转移组p27kipl蛋白的阳性率为71.4%,显著高于有淋巴结转移组p27kipl蛋白的阳性率（27.8%），p27kipl蛋白的表达与患者的年龄和性别及病理类型无显著关系（P＞0.05）。
2.3 胆囊癌Survivin与p27kipl的相关性 39例Survivin阳性表达者中表达p27kipl阳性为13例（33.3%），11例Survivin阴性表达者中表达p27kipl阳性9例（81.8%），两者的表达呈负相关（P ＜0.05）。
3 讨论
3.1 p27kipl蛋白与胆囊癌 p27kipl是新近发现的细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子（CDK-inhibitor, CDKI）家族成员之一，其主要作用是通过抑制Cyclin D-CDK2和Cyclin E-CDK2等Ｇ1期激酶的活性，使细胞停滞于Ｇ1期，从而抑制细胞增殖。本组研究发现，在胆囊息肉、胆囊炎中p27阳性表达率分别为100%和90%，在胆囊癌组织中，其阳性表达率为44%，在分化差的胆囊癌组织中p27kipl蛋白表达率明显低于分化较好的胆囊癌，有淋巴结转移组p27kipl蛋白阳性表达率明显低于无淋巴结转移组。随着肿瘤分期的进展，其阳性率表达也逐渐下降，说明p27kipl的表达改变与肿瘤的发生早期、、转移及侵袭性都有关，而且p27kipl表达水平下调与淋巴结转移有关，与临床分期呈负相关，说明p27kipl下调是胆囊癌发生的后期事件，可能与肿瘤演进和转移有关。由此显示，检测p27kipl在胆囊癌组织中表达有助于反映胆囊癌的生物学特性，可作为判断患者预后的一个新的有价值的生物学指标，为胆囊癌基因提供实验依据。
3.2 Survivin蛋白与胆囊癌 Survivin是凋亡抑制蛋白家族中结构独特的新成员，由Altieri等［1］在1997年发现。其结构仅有一个杆状病毒凋亡抑制蛋白结构域，并且没有碳末端的环指结构，在调节细胞凋亡方面有重要作用，可直接抑制凋亡效应分子Caspase-3和Caspase-7，使CDK4/CDK2激酶活性增强，促使癌细胞由G1进入S期，从而促进细胞增殖。它在人胚胎和胎儿期表达丰富，而在大多数终末分化的成人组织中（子宫内膜、胸腺和胎盘组织除外）不表达［２，3］，但在几乎所有的恶性肿瘤组织中均可检测到Survivin mRNA和蛋白的表达。研究表明，Survivin的存在代表着细胞生物学转化的中心环节，因而具有早期诊断的价值。本研究显示，通过免疫组织化学方法检测20例胆囊息肉及20例胆囊炎蜡块标本，无Survivin阳性表达，而在胆囊癌组织中高表达（78%），且Survivin表达与胆囊癌患者性别、年龄、病理分级、Nevin分期和淋巴结转移无关。由此推测Survivin阳性表达发生在胆囊癌早期阶段，检测血清中抗Survivin抗体及胆汁脱落细胞的Survivin表达，将有助于胆囊癌的早期诊断。此外，鉴于Survivin在胆囊癌组织中高表达而在胆囊炎及胆囊息肉组织中不表达，推测可能与细胞永生化和癌变有关，可作为基因治疗靶点，显示抗Survivin基因在肿瘤基因治疗方面具有良好的应用前景。
3.3 Survivin和p27kipl之间的相互关系 本研究表明，Survivin表达阳性的胆囊癌组织中，p27kipl阳性表达率明显低于Survivin表达阴性者，这说明Survivin和p27kipl的表达呈负相关。其可能的原因是，p27kipl使细胞停滞在G1期,无法进入S期，而Survivin蛋白只在G2/M期表达，因此p27kipl阳性表达的胆囊癌中，Survivin表达为阴性或弱阳性。近些年也有报道，p27kipl基因转移能下调Survivin表达［4，5］，Survivin具有细胞周期依赖性表达的特性，主要在G2/M期表达，p27kipl能使细胞产生G1阻滞，导致Survivin表达下降，这可能是p27kipl下调Survivin表达的主要原因。
综上所述，p27kipl在胆囊癌中表达降低，其表达与肿瘤分化程度、淋巴转移及分期等密切相关，p27kipl不但可以反映肿瘤的恶性度，而且可作为判断胆囊癌预后的独立指标。Survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，它的抗凋亡作用能对抗多种刺激所诱导的凋亡。以Survivin和p27kipl为靶点的基因治疗技术可能抑制细胞增殖，促进细胞凋亡及分化成熟，降低细胞凋亡的阈值［6］，从而为胆囊癌的治疗提供一条新的思路。
【文献】
[1] Duckett CS, Li F, Wang Y, et al. Human IAP-like protein regulates pogrammed cell death downstream of Bcl-xl and cytochromec[J]. Mol Cell Biol, 1998,18（1）:608-615.
[2] Adida C, Crotty PL, McGrath J, et al. Developmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosis gene survivin in human and mouse differentiation[J]. Am J Pathol, 1998，152（1）:43-49.
[3] Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene survivin expressed in cancer and lymphoma[J]. Nat Med, 1997,3（8）:917-921.
[4] Shamma A, Doki Y, Tsujinaka T, et al. Loss of p27（ KIPL） expression predicts poor prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncology, 2000,58（2）:152-158.
[5] Li F, AmbrosiniG, Chu EY, et al. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin[J]. Nature, 1998,396（6711）:580-584.
[6] Andersen MH, Thor SP. Survivin: a universal tumor antigen[J]. Histol Histopathol, 2002,17（2）:669-675.
