VEGF-C对肝门部胆管癌细胞增殖以及侵袭能力的影响
【摘要】 目的：探讨血管内皮生长因子-C（VEGF-C）对肝门部胆管癌细胞侵袭和增殖的影响。方法：采用MTT法测定VEGF-C对肝门部胆管癌细胞系（FRH0201）细胞增殖的影响，流式细胞仪观察VEGF-C抗凋亡作用，应用3H-TdR 掺入试验测定VEGF-C对FRH0201细胞同质黏附作用以及Boyden小室观察VEGF-C诱导肝门部胆管癌细胞转移的作用。结果：MTT法示VEGF-C能显著提高FRH0201的增殖活性，其效应随VEGF-C剂量以及时间增加而增加，并显著抑制细胞凋亡。在Boyden小室培养的FRH0201细胞中分别加入1、5和10 ng/ml的 VEGF-C 刺激培养后， Boyden小室碳酸酯滤膜下层浸润的胆管癌细胞数均高于对照组。分别用上述浓度的VEGF-C诱导FRH0201 60、90和120 min后，FRH0201细胞的黏附能力显著低于对照组。结论：VEGF-C可以促进胆管癌细胞增殖，抑制其凋亡，增强细胞侵袭能力，并且与降低细胞的同质黏附作用密切相关。
【关键词】 血管内皮生长因子C 胆管肿瘤 细胞增殖 肿瘤转移 细胞黏附
Effect of vascular endothelial growth factor-C on
【ABSTRACT】 Objective: To investigate the effect of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) on invasive capability and proliferation of human cholangiocarcinoma cells. Methods: The effect of VEGF-C on FRH0201 was assayed by MTT. The cycle pattern and apoptosis was assayed using flow cytometry. The effect of VEGF-C on homotypic adhesion and metastasis in FRH0201 was examined with 3H-TdR infiltration and Boyden chamber. Results: VEGF-C could enhance the proliferation of FRH0201 in a dose and time dependent manner. And VEGF-C could inhibit cell apoptosis significantly. After cultured for 2 hours with 1, 5, 10ng/ml of VEGF-C, there were more cells in the lower chamber than the control group. After 60, 90, 120 minutes induction by 1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml, the cells showed significantly lower homotypic adhesion than that of the control group. Conclusions: VEGF-C could enhance the proliferation of FRH0201 and inhibit cell apoptosis. VEGF-C could decrease homotypic adhesion of FRH0201 and might be a cause of the metastasis.
【KＥＹ WORDS】 Vascular endothelial growth factor C·Bile duct neoplasms·Cell Proliferation·Neoplasm metastasis·Cell adhesion
肝门部胆管癌是一种区域性疾病，具有沿神经周围淋巴间隙以“跳跃”形式转移的特点，但其转移复发的机制尚未完全明确［1］。而血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C）在调节肿瘤血管新生以及淋巴管生成，促进肿瘤细胞进入淋巴管，通过淋巴系统向全身转移中具有重要的作用［2］。本研究以胆管癌细胞系FRH0201为研究对象，通过观察VEGF-C对其增殖、侵袭以及黏附作用的影响，进一步研究肝门部胆管癌细胞的侵袭转移机制。
1 材料与方法
1.1 材料 人肝门部胆管癌细胞株FRH0201由吴小鹏教授建立［３］，重组VEGF-C购自美国Sigma公司，用无血清RPMI 1640培养液配制成200 ng/ml,置于-20℃冰箱保存待用；3H-TdR由北京原子能研究所提供；Boyden小室（膜孔径8 μｍ，直径8.5 mm）购于美国Neutroprobe公司；用人工重构基地膜材料Matrigel以及纤维连接蛋白Fn包被的96孔板，购自美国Sigma公司。
1.2 VEGF-C影响人肝门部胆管癌细胞增殖作用实验 取对数生长的人肝门部胆管癌细胞，制成5×104/ml浓度的细胞悬液。将人肝门部胆管癌细胞悬液接种于96孔板，100 μl每孔，每组6孔，设6组。37℃、5％CO2培养6 h待细胞贴壁后，弃原培养液，每孔分别加入VEGF-C条件培养液100 μl，单纯应用无血清RPMI 1640培养液的为空白对照组，各实验组的VEGF-C的终浓度分别为1、5、10、50和100 ng/ml，37℃，5％CO2分别培养24、48和72 h。每孔加入MTT（5 mg/ml）10 μl，继续培养4 h，离心去上清，每孔加入DMSO 150 μl，振荡10 min，酶标仪测490 nm处OD值。再取浓度分别为1 、5 和50 ng/ml的VEGF-C条件培养液，培养的人肝门部胆管癌细胞，制成1×106 ml-1的细胞悬液，送流式细胞仪检测细胞周期。
1.3 VEGF-C诱导人肝门部胆管癌细胞侵袭实验 用Boyden趋化小室进行细胞迁移能力的检测［4］ 取对数生长的人肝门部胆管癌细胞弃原培养液，加入无血清RPMI 1640培养液培养24 h，然后制成1×106 ml-1浓度的细胞悬液。设无血清RPMI 1640对照组，VEGF-C 1、5 和10 ng/ml 3个不同浓度组，每组Boyden趋化小室下室加入混有不同浓度VEGF-C的无血清RPMI 1640培养液200 μl，然后盖上微孔多聚碳酸酯滤膜，在上层加入制备好的胆管癌细胞悬液800 μl，于37℃、5％CO2培养条件下培养2h。培养结束后，拆卸装置，用棉签擦去多聚碳酸酯滤膜上层的细胞，然后用乙醇固定，Giemsa染色。在400倍光学显微镜下每张膜随机观察5个视野，计数每个视野的细胞数。实验重复3次，每个不同浓度组的迁移细胞数为15个视野的平均细胞数。
1.4 细胞间黏附实验（同质黏附实验）［５］ 取对数生长的人肝门部胆管癌细胞弃原培养液，加入3H-TdR（5 μCi/ml）标记的新鲜无血清RPMI 1640培养液，标记24 h后，以Hanks液洗涤数次，并制备成1×105 ml－１浓度的细胞悬液。将标记的细胞悬液100 μl接种于以Matrigel和Fn包被的96孔板。设单纯应用无血清RPMI 1640培养液的为空白对照组，各实验组的VEGF-C终浓度分别为1、5 和10 ng/ml,共4组，每组8孔，分别培养60 、90 和120 min，取每组平均值。培养结束后，弃原培养液，用PBS洗涤数次，收集细胞至醋酸纤维滤纸上，烤干后置于闪烁液中，BACKMAN-L600闪烁仪测定脉冲数。
1.5 统计学处理 数据以x±s表示，应用SPSS10.0统计软件进行t检验统计分析，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度VEGF-C对人肝门部胆管癌细胞增殖作用的影响 实验结果见表1、表2及图1。结果提示VEGF-C对人肝门部胆管癌细胞有明显的促进增殖的作用，具有剂量-时间依赖性。根据细胞生长曲线， VEGF-C浓度在1和5 ng/ml组，细胞增殖明显，超过10 ng/ml时，增殖作用逐渐变缓， 100 ng/ml浓度组未出现抑制现象。流式细胞仪检测发现，VEGF-C可以抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，随VEGF-C剂量的增加，处在S期以及G2/M期的细胞数越多，处在G1期的细胞数越少,在VEGF-C剂量超过5 ng/ml时，处在G2/M期的细胞数随之增加。
2.2 不同浓度VEGF-C诱导人肝门部胆管癌细胞侵袭能力 VEGF-C 1、5和10 ng/ml组作用2 h后，趋化小室多聚碳酸酯滤膜下层的人肝门部胆管癌细胞数分别为（31±12）、（41±14）、（57±17）,均高于对照组细胞数（18±6），P＜0.01。见图2。
2.3 不同浓度VEGF-C对人肝门部胆管癌细胞同质黏附作用的影响 1 ng/ml VEGF-C作用于人肝门部胆管癌细胞120 min后，同质黏附作用显著降低（P＜0.01）；5 ng/ml、10 ng/ml VEGF-C作用于人肝门部胆管癌细胞60、90 min后，对细胞同质黏附作用降低有显著性（P＜0.05），作用120 min后，同质黏附作用的显著降低（P＜0.01）。见表3。
3 讨论
胆管癌起病隐匿，易于向邻近的重要解剖结构侵犯和转移，在获得临床诊断时，患者往往已丧失最佳手术时机。研究表明，大部分胆管癌组织中有VEGF-C的表达，其中41.7％的表达强阳性，27.8％的表达弱阳性［６］。VEGF-C与许多肿瘤发生有关［７－９］，在调节肿瘤血管新生以及淋巴管生成、肿瘤细胞进入淋巴管、促进肿瘤细胞转移的过程中起着重要的作用［１０，１１］。
VEGF是一种能产生多种生物学效应的细胞因子，是从牛垂体滤泡星状细胞培养液中分离纯化出来［１２］的血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）家族的成员，相对分子质量为（34～45）×103，序列高度保守，分布广泛。VEGF-C是VEGF家族的新成员，是进化上高度保守的糖蛋白，羟基末端有8个Cys形成的分子内或分子间二硫键，它位于染色体4q34，相对分子质量约为46.9×103。其受体(VEGFR)的膜外区都具有7个免疫球蛋白样同源结构域以及膜内酪氨酸激酶，目前已知有两种，分别为VEGFR2和VEGFR3。有的研究发现VEGF-C可以通过激活基质金属蛋白酶(MMP)，增强其与受体的亲和力，促进肿瘤细胞增殖，增强血管通透性，有利于肿瘤细胞转移。肿瘤VEGF-C的过度表达可以引起外周淋巴血管直径增加，增加肿瘤细胞与淋巴血管的接触面积。VEGF-C还可以与其受体结合，通过PI3K依赖的途径激活抗凋亡蛋白Akt/PKB,从而抑制细胞凋亡［13］。
研究发现，VEGF-C促进细胞增殖呈剂量-时间依赖性，在1 ng/ml和10 ng/ml浓度时，细胞增殖明显，在100 ng/ml浓度范围内未出现抑制现象。通过流式细胞仪检测发现，VEGF-C可以抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，随VEGF-C剂量的增加，处在S期以及G2/M期的细胞数越多，处在G1期的细胞数越少,在VEGF-C剂量超过5 ng/ml时，处在G2/M期的细胞数随之增加。本研究还发现，VEGF-C可以使胆管癌细胞穿透碳酸酯滤膜基质的能力增强，而且呈浓度依赖性。VEGF-C作用于胆管癌细胞120 min后，降低细胞同质黏附的作用比60和90 min更强，表明VEGF-C可以显著降低胆管癌细胞间同质黏附作用，并且呈时间-剂量依赖关系,这个结果与VEGF-C作用于细胞2 h后通过碳酸酯滤膜基质的细胞数到达高峰相一致。同质黏附作用的降低可以促进肿瘤细胞容易从瘤体脱落，脱离的细胞与基质的胶原纤维黏附，有利于肿瘤细胞的运动以及转移灶的形成。说明肿瘤细胞运动侵袭能力的增强，与其同质黏附作用的降低密切相关。
总之，VEGF-C可以促进胆管癌细胞增殖，抑制其凋亡；可以增强细胞侵袭能力，并且与降低细胞的同质黏附作用密切相关。但是，应用VEGF-C的特异性受体阻断剂是否明显降低细胞转移能力，以及VEGF-C具体通过什么途径起作用，还需进一步深入研究。
【】
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