雌激素诱发大鼠催乳素瘤的机制与研究

【摘要】  目的 通过分析雌激素对大鼠垂体Pit?1基因表达的作用，探讨雌激素诱发大鼠催乳素瘤的发病机制。方法 成年雌性Wistar大鼠，去势手术后分2组：(1) 对照组(C组，n=16)皮下植入空白硅胶管；(2) 雌激素组(E组，n=16)：皮下植入含有乙稀雌酚的硅胶管。分别于用药第2、4、6、8周处死动物。垂体称重。用放免法测定大鼠血清PRL水平。用反转录?PCR方法检测Pit?1 mRNA在各组垂体组织中的表达量。结果 在用药第2、4、6、8周，大鼠血清PRL水平、垂体重量、垂体组织Pit?1 mRNA水平均逐渐增高，垂体组织Pit?1 mRNA水平与大鼠血清PRL水平和垂体重量均呈明显正相关(相关系数分别为0.946和0.913，P=0.01)。结论 雌激素刺激垂体组织表达Pit?1基因， Pit?1在雌激素诱发的大鼠PRL瘤的发生中起重要作用。

【关键词】  发病机制；大鼠；催乳素瘤；雌激素；Pit?1

　　The Mechanism of Estrogen on Estrogen Induced Prolactinomas in Rats

　　　　Abstract：Objective   To study the mechanism of estrogen on estrogen induced prolactinomas in rats.Methods  Adult Wistar rats were divided into 2 groups at random.Each rat in control group(n=16)were subscutaneously   implanted with a blank implant.Rats in estrogen  group（n=16） were implanted with  estrogen?containing implants.The  animals   were executed after 2,4,6,8 weeks.Serum prolactin(PRL)  levels  were  measured  by  RIA  method.Pit?1 mRNA level in pituitary tissue were measured by RT?PCR method.Results  Pit?1 mRNA  levels were different among 2,4,6,8 weeks and increased along with 2,4,6,8 weeks.There  was a   positive  relation  between   Pit?1 mRNA levels and   serum  PRL  levels (γ= 0.964,P=0.01).There  was also a   positive  relation  between   Pit?1 mRNA levels and pituitary weights(γ= 0.913，P=0.01).Conclusion  Estrogen   has  a  stimulating  effect  on the expression of Pit?1  gene,which plays an important role on estrogen induced prolactinoma.

　　Key words：Mechanism;Estrogen;Prolactinomas;Rats;Pit?1

　　雌激素是垂体催乳素（PRL）细胞增生和PRL基因表达强有力的刺激因子,雌激素作用于垂体PRL细胞上的雌激素受体，雌激素?雌激素受体复合物通过细胞内的一系列生物学效应引起PRL的分泌和PRL细胞的增生，最终形成PRL瘤。雌激素?雌激素受体复合物通过何种途径或与何种因子共同作用导致PRL的分泌和PRL细胞的增生？最近研究发现，在PRL基因的近端启动子和远端增强子存在Pit?1特异性的结合部位,PRL基因的正常表达需要Pit?1蛋白与雌激素?雌激素受体的协同作用[1，2]。本研究通过分析Pit?1基因在雌激素诱发的大鼠PRL瘤中的表达,探讨雌激素对垂体PRL细胞的作用机制。                                       
　　1材料与方法

　　1.1大鼠PRL瘤的制备
       
　　成年雌性Wistar大鼠，体重120～150g，腹腔内注射10%水合氯醛50～80mg/kg，大鼠完全麻醉后,常规消毒,于背部腰椎两侧做长约2～3cm的纵形切口,暴露腹腔,结扎子宫,切除卵巢,并逐层缝合。于其背部中线尾骨上约3cm偏左处作一约1cm长纵形口切，并游离皮下组织，随机将一含有乙稀雌酚20mg的硅胶管(长2cm,内径1.5mm,外径2.41mm)或空白硅胶管植入皮下。全部动物分2组：(1) 对照组(C组，n=16)皮下植入空白硅胶管；(2) 雌激素组(E组，n=16)：皮下植入含有乙稀雌酚的硅胶管。分别于用药第2、4、6、8周用乙醚麻醉大鼠，心脏穿刺取血分离血清于-70℃保存，打开颅骨，摘下垂体，称重后将一半冻于液氮中,一半放于4%多聚甲醛中固定。

　　1.2血清PRL水平的测定
      
　　大鼠血清PRL放免测定的抗原和抗体由NHPP惠赠。用氯胺?T法标记催乳素抗原,灵敏度为0.54ng/ml,批内CV为6.8%,批间CV为8.7%。

　　1.3垂体组织中Pit?1 mRNA表达量的检测

　　1.3.1总RNA的提取 

　　垂体组织15～30mg,用异硫氢酸胍一步法提取,RNA提取试剂盒(Trizol)购自GIBCORL公司。RNA含量（1 OD280=40μg/ml）。

　　1.3.2模板cDNA的合成 

　　总RNA 2μg中加入OligdT 0.5μg,置于70℃预变性5min，然后在冰浴中,依次加入以下反应物:5×Buffer 4μl,10×dNTP  2μl,RNasin 20U(购自Promega公司),AMV 10U(购自Promega公司),反应总体系为20μl。于42℃ 1h,98℃ 5min灭活反转录酶，RT产物于-20℃保存。

　　1.3.3目的基因的扩增(PCR)    

　　Pit?1基因的上游引物为5'?CACCTCGGCTGATACCTTT?3',下游引物为'?GTTTGCTCCCACTTTTTC?3'[3],扩增产物为616bp。在25μl的反应体系中依次加入10×Buffer 2.5μl，2.5×dNTP 3μl,引物(上游和下游各)20pmol,逆转录产物0.5～3μl标和无菌去离子水,混匀,加液体石腊油覆盖,进行PCR扩增反应。98℃ 10min预变性后在88℃下 加Taq酶(1/管)，以β?actin做内对照，上游引物为5'?CGTTGACATCCGTAAAGA?3'，下游引物为5'?AGCCACCAATCCACACAG?3'。于94℃变性 1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min。

　　1.3.4PCR产物的检测 

　　制备1.5%的琼脂糖凝胶,含溴化乙啶0.5μg/ml,PCR产物与载体缓冲液比例为6∶1,在70V恒压电泳20min,于UVP计算机图像分析系统测定样本灰度值,以β?actin作为内参照,计算相对含量。

　　1.3.5统计学分析 

　　所有实验数据以均数±标准差表示,用SPSS统计软件分析，两组间差异用t检验，多组间差异用方差分析，用回归分析方法判断两因素之间是否存在相关性。

　　2结果

    见图1。

　　2.1大鼠垂体重量的比较

    在用药2、4、6、8周，C组大鼠垂体重量分别为（14.2±1.8）mg、(15.7±1.7)mg、(14.4±2.0)mg和(13.0±1.6）mg,无明显差别(F=1.61,P=0.239)；E组垂体重量分别为（21.5±3.2）mg、（30.6±3.1）、(45.5±8.7)mg、(74.1±8.4)mg呈逐渐增加的趋势，有统计学差别(F=53.055,P<0.001)。在用药2、4、6、8周，E组垂体重量均分别高于C组,具有统计学差别，t值分别为5.934、8.381、6.997和14.225，P值分别为0.001、<0.001、<0.001和<0.001。

　　2.2大鼠血清PRL水平的比较

    在用药2、4、6、8周，C组大鼠血清PRL水平分别为（18.3±5.1）μg/L、（23.6±7.0）μg/L、（22.4±4.5）μg/L、（25.9±8.8）μg/L 无明显差别（F=0.939，P<0.001）；E组血清PRL水平分别为（152.4±65.1）μg/L、（791.9±124.1）μg/L、（2235.9±229.0）μg/L、（4622.8±712.6）μg/L，呈逐渐增加的趋势，有统计学差别（F=108.518，P<0.001）。E组大鼠血清PRL水平均分别高于C组,有统计学差别，t值分别为4.109、12.363、19.382和12.901，P值分别为0.006、<0.001、<0.001和<0.001。

　　2.3Pit?1 mRNA在垂体组织中表达水平的比较
     
　　用2%琼脂糖凝胶电泳检测RT?PCR产物,以大鼠脂肪组织做阴性对照，E组和C组标本在616bp处均有清晰的带型，说明Pit?1 mRNA在两组大鼠垂体组织中均有表达,见图2。

    在用药2、4、6、8周，C组大鼠垂体组织Pit?1 mRNA水平分别为0.8±0.4、1.0±0.4、1.2±0.4、0.8±0.4，无明显差别（F=0.870，P=0.484）。E组Pit?1 mRNA水平分别为1.4±0.4、2.6±0.1、3.4±0.2、5.5±0.4，呈逐渐增加的趋势，具有统计学差别（F=123.850，P<0.001）。在用药2、4、6、8周，E组Pit?1 mRNA水平均分别高于C组，具有统计学差别，t值分别为2.504、7.735、10.371和16.726，P值分别为0.046、<0.001、<0.001和<0.001。

　　2.4Pit?1 mRNA水平与血清PRL值的关系

    E组大鼠垂体组织Pit?1 mRNA水平与大鼠血清PRL值呈正相关，相关系数为0.964（P=0.01）。

　　2.5Pit?1 mRNA水平与大鼠垂体重量的关系

    E组大鼠垂体组织Pit?1 mRNA水平与垂体重量呈明显正相关，相关系数为0.913（P=0.01）。

　　3讨论
      
　　Pit?1蛋白是POU ( Pit?1,Oct?1，Oct?2 and Unc?86的缩写)家族的成员之一，是垂体特异的转录因子。对垂体生长激素（GH）细胞、PRL细胞以及促甲状腺素（TSH）细胞的发育、分化和增生均有重要的调节作用[4，5]。有报道Pit?1基因在人垂体PRL瘤和GH瘤中的表达量明显增高,提示Pit?1对人垂体GH和PRL腺瘤细胞分化和增生具有一定的作用[6]。本研究发现，在雌激素诱发大鼠PRL瘤的过程中，大鼠垂体组织Pit?1 mRNA水平逐渐增高，Pit?1的表达量分别与大鼠血清PRL水平和垂体重量呈明显的正相关,提示Pit?1与大鼠垂体PRL基因的表达和PRL细胞的增生密切相关。

    Pit?1的表达受性激素的调节。雄性大鼠去势后,垂体组织的Pit?1 mRNA水平明显下降,补充生理剂量睾酮可以阻止其下降[7]。本研究用去势的雌性大鼠为研究对象,在雌激素的作用下，垂体PRL瘤组织Pit?1基因的表达量逐渐升高,说明雌激素刺激垂体组织Pit?1基因的表达。体外培养研究发现，雌激素直接刺激Pit?1 mRNA的表达,双氢睾酮(DHT)则不具备这一作用,提示雌激素直接作用于垂体影响Pit?1基因的表达。

     有学者分析Pit?1基因和雌激素受体基因在人PRL瘤中的表达，发现80%的PRL瘤表达Pit?1基因，94%的PRL瘤表达雌激素受体基因，其表达局限于PRL细胞中，提示Pit?1和雌激素受体在PRL瘤的分化和中起协同作用[8]。在雌激素诱发大鼠PRL瘤的发生和发展中同样需要雌激素受体和Pit?1的共同作用。我们曾研究发现雌激素受体在雌激素诱发的大鼠PRL瘤中的表达明显增高[9]，本研究结果显示Pit?1在雌激素诱发的大鼠PRL瘤中的表达明显增高，这些结果提示，雌激素刺激垂体组织表达雌激素受体以及Pit?1基因是雌激素诱发大鼠高PRL血症的机制之一。
      
　　结论: 雌激素刺激垂体组织表达Pit?1基因,Pit?1在PRL基因的表达和PRL细胞的增生中起重要作用。

【】
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　　［2］Diamond SE,Chiono M,Gutierrez?Hartmann A.Reconstitution of the protein kinase A response of the rat prolactin promoter: Differential effects of distinct Pit?1 isoforms and functional interaction with Oct?1［J］.Mol Endocrinol,1999,13(2):228?232．

　　［3］Lee BJ， Kim JH， Lee CK,et al.Changes in mRNA levels of a pituitary?specific trans?acting factor,Pit?1,and prolactin During the rat estrous cycle.Eur J Endocrinol［J］.1995,132(6):771?776．

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　　［7］Gonzalez?Parra S,Chowen JA,Garcia?Segura LM,et al.In vivo and in vitro regulation of pituitary transcription factor?1 (Pit?1) by changes in the hormone environment［J］.NeuroenDocrinology,1996,63(1):3?15．

　　［8］Sanno N,Teramoto A,Matsuno A,et al.Expression of Pit?1 and estrogen receptor messenger RNA in prolactin?producing pituitary adenomas［J］. Mod?Pathol,1996,9(5):526?533．

　　［9］徐春,李江源,黄兆坚.雌激素受体基因在乙稀雌酚诱发的大鼠泌乳素瘤中的表达［J］.中华内分泌代谢杂志，2001,17(1):47?50.