末端Galβ1?4GlcNAc多糖分子在肿瘤患者血清中的表达

           作者：邹宁,宫卫东，周媛，张积仁'

【摘要】  目的 研究末端Galβ1?4GlcNAc多糖分子在鼻咽癌、肺癌、肝癌和结直肠癌患者血清中的表达。方法 应用RCAⅠ（蓖麻凝集素Ⅰ）亲和层析法从正常人血清中获得RCAⅠ相关末端Galβ1?4GlcNAc糖蛋白，用辣根过氧化物酶标记，采用凝集素差减法，对133例肿瘤患者，64例良性疾病患者和240例正常人血清进行检测。结果 鼻咽癌、肝癌和结直肠癌患者血清中RCAⅠ识别的多糖分子明显高于正常人和良性疾病患者，阳性率分别为66.7％、73.9％、64.9％；肺癌患者血清阳性率为19.4％。且在鼻咽癌和结直肠癌患者有效后该多糖分子水平显著下降，阳性率也下降。结论 血清中RCAⅠ相关的末端Galβ1?4GlcNAc多糖分子，可用于肿瘤患者血清糖基化异常和肿瘤发病机制的研究，并可为临床诊断和治疗效果的评价提供指标。

【关键词】  RCAⅠ;多糖;肿瘤

　　Investigation of Expression of the Terminal Galbeta1?4GlcNAc Related Polysaccharide in Serum of Malignant Tumors Patients

　　Abstract：Objective   To detect the expression of the terminal Galbeta1?4GlcNAc related polysa? ccharide in serum of nasopharyngeal carcinoma,primary liver cancer,and colorectal cancer and lung cancer patients.Methods  The RCAⅠidentifying Terminal Galβ1?4 GlcNAc glycoprotein was acquired by RCAⅠ(Ricinus communis agglutininⅠ) affinity chromatography method from nor? mal person serum and was marked by the horseradish peroxidase.133 tumor patients,64 benign disease patients and 240 normal person serums were detected by the subtraction of agglutinin.Results  The polysaccharide level of the RCAⅠidentification in serum of  nasopharyngeal ca? rcinoma,primary liver cancer and colorectal cancer was obvious higher than it in normal person and benign disease patients.The positive rate was 66.7%,73.9% and 64.9% relatively. Lung cancer had only positive rate 19.4%. After effective therapy,the polysaccharide lever of the RCAⅠidentification in serum of nasopharyngeal carcinoma and colorectal cancer remarkably descent,the positive rate also descent.Conclusion  The terminal Galbeta1?4GlcNAc related polysac? haride in serum can be applied to the research of abnormal polysaccharide in tumor patient and pathogenesis. Its level can provide reference for clinical diagnosis and the evaluation on curative effect.

　　Key words：RCAⅠ;Polysaccharide;Tumor

　　0 引言

    正常情况下，细胞膜和血清中存在凝集素识别的多糖分子，且其水平相对稳定。当细胞恶变时，多糖分子的数量和性质亦随之发生改变，并可反应在对凝集素结合的能力上［1］。凝集素是一类无免疫原性、能识别糖链结构的蛋白质，其结合的专一性类似于抗原抗体反应［2］。用凝集素作为探针，可以检测肿瘤细胞表面、细胞内和血清中多糖水平。根据上述特性，本实验应用了能与末端Galβ1?4GlcNAc多糖分子特异性结合的RCAⅠ［3，4］，亲和纯化正常人血清中末端Galβ1?4GlcNAc糖蛋白，采用凝集素差减法检测鼻咽癌、肺癌、肝癌、结肠癌患者血清中的末端Galβ1?4GlcNAc多糖分子表达水平，探讨其在肿瘤发生及临床中的意义。

　　1材料和方法

　　1.1主要试剂

    RCAⅠ购自Vector公司，RCAⅠ?Sepharose4B购自Sigma公司，辣根过氧化物酶为Roche公司进口分装。

　　1.2 血清标本收集

    收集珠江病理确诊的肿瘤患者血清133例，鼻咽癌42，其中收集了31例鼻咽癌患者治疗前后血清，肺癌 31 例，肝癌23例，结直肠癌37例，其中33例结直肠癌患者分别收集了治疗前后血清。另收集的良性疾病血清64例均取自本院住院病人。240例正常人血清取自本院体检正常者。年龄在20～76岁之间。血清收集后于-70℃存放，待检。

　　1.3 方法

　　1.3.1RCAⅠ结合糖蛋白的制备和辣根过氧化物酶标记

    收集健康人血清A、B、O 3型等比混合30ml,利用2.3%利凡诺溶液与血清中的白蛋白络合形成硬块,以除去白蛋白［5］,将除去白蛋白的液体对0.01M PBS透析,以除去其中的利凡诺分子。取上述液体分别与RCAⅠ?Sepharose4B混合反应后，用亲和层析法纯化RCAⅠ结合糖蛋白［6］。将上述糖蛋白收集后，分别透析、浓缩。辣根过氧化物酶标记糖蛋白，取RCAⅠ亲和层析纯化的糖蛋白5mg，按常规方法与10mg 辣根过氧化物酶进行标记［7］。

　　1.3.2血清RCAⅠ识别的多糖分子的检测

    取RCAⅠ溶于凝集素稀释液中，浓度为0.0125mg/ml,包被96孔ELISA板上,每孔100μl,4℃过夜,PBS缓冲液洗1次,分别加入检测血清100μl,4℃反应4h,PBS洗3次,加入辣根过氧化物酶标记的糖蛋白,每孔100μl,4℃反应4h,PBS洗3次,TMB?H2O2显色10min,中止反应后,酶联免疫检测仪波长450nm测OD值［8］。

　　1.3.3实验对照和质控曲线的建立

    取亲和纯化的糖蛋白代替检测血清做阳性对照;用PBS代替检测血清做阴性对照；用稀释不同浓度的糖蛋白代替血清做质量控制；其他步骤不变。

　　1.3.4统计学处理

    经SPSS10.0统计软件处理，采用方差分析和χ2检验。

　　2结果

　　2.1RCAⅠ结合糖蛋白的制备

    30ml血清除去白蛋白后的透析液约60ml。经RCAⅠ?Sepharose4B亲和层析纯化后,考马斯亮蓝染色法测得所获纯化糖蛋白含量为6.9mg。

　　2.2 RCAⅠ结合糖蛋白的标记

    取5mg亲和纯化的糖蛋白与10mg辣根过氧化物酶混合后标记，标记后ELISA测定效价为1∶512［8］。

　　2.3血清RCAⅠ识别的多糖分子的检测结果

    在包被RCAⅠ一定且过量和检测血清一定的情况下，血清中该多糖分子含量越高，与RCAⅠ反应后，辣根过氧化酶标记的糖蛋白被RCAⅠ识别的则越少，ELISA测定值越低，两者成反比关系。与质控曲线对照，经SPSS10.0统计软件处理，以正常人组检测的平均值减1.64个标准差后值作为判断阳性的阈值,见表1。表1  血清RCAⅠ识别的多糖分子的检测结果（略）

　　2.4良性疾病的病种构成及检测结果

    在64例良性疾病中，良性呼吸系统疾病41例，阳性8例，其中6例为慢性肺心病。良性消化系统疾病患者23例，阳性4例，其中3例为胆结石患者。

　　2.5肝癌患者检测结果

    在23例肝癌患者中有17例阳性，其中10例有远处转移，3例肝内弥漫性病变，4例病情稳定。

　　2.6在31例鼻咽癌患者（放±化疗）前后血清中该多糖分子的检测结果

    治疗前后的OD值和阳性率有显著差异，治疗后的OD值较治疗前增高，治疗后的阳性率降低，说明鼻咽癌患者治疗后血清中该多糖分子较治疗前显著降低，见表2。表2  鼻咽癌患者治疗前后血清RCAⅠ识别的多糖分子的检测结果（略）

　　2.7在33例结直肠癌患者治疗前后血清中该多糖分子的检测结果

    治疗前后的OD值和阳性率有显著差异，治疗后的OD值较治疗前高，治疗后的阳性率降低，说明治疗后结直肠癌患者血清中该多糖分子较治疗前明显降低。治疗后9例阳性患者中，有7例为进展期患者，2例为有远处转移的患者。说明治疗未控时该多糖分子仍为阳性，见表3。表3  结直肠癌患者治疗前后血清RCAⅠ（略）

　　3讨论

    现已发现肿瘤细胞内糖基化过程发生变异，导致细胞分泌性或细胞膜上的糖蛋白或糖脂中的糖链序列发生改变［9］,这些糖链与细胞的粘附、运动、分子识别及细胞识别有关，糖链结构改变可能导致肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的识别而生长和转移。利用凝集素的糖结合特异性可以检测这种改变［10］。RCAⅠ能够特异性识别具有末端Galβ1?4GlcNAc糖链序列的多糖分子。本研究利用RCAⅠ这的特性进行研究，结果证实血清中存在RCAⅠ识别的具有末端Galβ1?4GlcNAc糖链序列的多糖分子，并首次利用亲和层析的方法从血清中分离出该物质。本研究发现在鼻咽癌、肝癌和结直肠癌患者血清中该多糖分子水平显著增高，阳性率分别为66.7％、73.9％和64.9％。其阳性率和肝癌的AFP，结直肠癌的CEA相当，但本实验不需要制备抗体，方法简单。且在鼻咽癌和结直肠癌得到有效治疗后该多糖分子水平显著下降，阳性率也下降，在治疗未控时，该多糖分子仍为阳性。这一研究结果提示该多糖分子水平增高与肿瘤发生有一定关系，对于鼻咽癌和结直肠癌标志物的寻找，治疗疗效的判断具有一定意义。而在肺癌患者，该多糖分子阳性率和良性疾病患者无明显差别，表明该多糖分子对于肺癌的临床诊断意义不大。
   
　　本实验利用了凝集素和多糖分子特异性结合的原理，检测血清中RCAⅠ相关的末端Galβ1?4GlcNAc多糖分子，可用于肿瘤患者血清糖基化异常和肿瘤发病机制的研究，并可为临床诊断和治疗效果的评价提供指标。

【参考】
  　　［1］陈国千,吕元.糖蛋白糖链结构分析与恶性肿瘤的诊断[J].国外医学临床生物化学与检验学分册，2000,21(4):171?173.

　　［2］Peumans WJ,Van Damme EJ,Barre A.Classification of plant lectins in families of structurally and evolutionary related proteins［J］.Adv Exp Med Biol,2001,49(1):27?54.

　　［3］Albert M Wu,June H Wu,Tanuja S,et al. Recognition factors of Ricinus communis agglutinin 1 (RCA(1)). Mol Immunol,2006,43(10):1700?1715.

　　［4］Critchley P,Willand MN,Rullay AK,et al. Carbohydrate?protein interactions at interfaces: synthe?sis of thiolactosyl glycolipids and design of a working model for surface plasmon reso?nance［J］. Org Biomol Chem,March 21,2003,1(6): 928?938.

　　［5］陶永辉，金坚，阮长耿.利凡诺去白蛋白人血浆再利用的实验研究Ⅰ.蛋白C和蛋白S的纯化与鉴定［J］.生化药物杂志，2001,22(3):121?124.

　　［6］张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］.第2版.杭州:浙江大学出版社,1999.471，517?518.

　　［7］何忠效.生物化学实验技术［M］.第1版.北京:化学出版社,2004：91?92.

　　［8］朱立平,陈学清. 免疫学常用实验方法［M］.第1版.北京:人民军医出版社,2000:321?324.

　　［9］Wanderley de Souza,José Andrés,Morgado?Díaz.Differential Expression of Sialic Acid and N?acetylgalactosamine Residues on the Cell Surface of Intestinal Epithelial Cells According to Normal or Metastatic Potential［J］.Journal of Histochemistry and Cytochemistry,2004,52(5):629?640.

　　［10］Rudiger H,Gabius HJ. Plant lectins: occurrence,biochemistry functions and applications［J］. Glycoconj J,2001,18(8)589?613.