辛伐他汀诱导K562细胞凋亡过程中Caspase?3、Caspase?9活性变化

              作者：黄文芳，杨永长,刘华，陈江，周定安

【摘要】  目的 观察辛伐他汀诱导K562细胞凋亡过程中Caspase?3、Caspase?9活性的变化。方法 不同浓度辛伐他汀处理K562细胞，用细胞形态学、流式细胞技术检测细胞凋亡，比色法测定Caspase?3、Caspase?9活性。结果 5、10、20μmol/L辛伐他汀作用K562细胞48h后出现核固缩、核碎裂和凋亡小体等形态学改变,其凋亡率分别为（4.00±0.13）%、（6.24±0.18）%、（9.41±0.22）%，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。作用72h后细胞凋亡率分别为(7.62±0.21)%、(12.41±0.32)%、(19.08±0.26)%，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。同时Caspase?3、Caspase?9活性明显升高，10μmol/L与20μmol/L组Caspase? 3、Caspase?9活性与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。结论 辛伐他汀可能通过活化Caspase?9，并进而活化Caspase?3诱导K562细胞凋亡。

【关键词】  辛伐他汀；Caspase；细胞凋亡

　　　Key words：Simvastatin;Caspase;Apoptosis

　　0引言

    凋亡受阻是恶性肿瘤细胞的显著特征，寻找有效途径诱导肿瘤细胞凋亡是当今医学界研究的热点之一。他汀类(statins)药物是内源性胆固醇合成限速酶???羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG?CoA）还原酶竞争抑制剂，能抑制甲羟戊酸途径，影响胞内信号转导。近年研究表明，他汀类药物能诱导间皮瘤 [1]、神经胶质瘤 [2]、急性髓样白血病 [3]和黑色素瘤[4]等多种肿瘤细胞凋亡，且对正常细胞无明显的毒副作用，但其凋亡的机制尚不完全明确。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific protease,Caspase）与细胞凋亡密切相关，研究表明他汀类药物诱导黑色素瘤和人横纹肌肉瘤细胞凋亡过程中均有Caspase的活化[4，5]。目前有关辛伐他汀诱导人红白血病K562细胞凋亡过程中是否有Caspase的活化未见报道，本研究采用分光光度法测定Caspase?3、?9活性，观察其在辛伐他汀诱导K562细胞凋亡中的变化。

　　1材料与方法

　　1.1细胞株人红白血病K562细胞株购自四川大学华西校区基础与法医学院免疫室。

　　1.2 主要试剂辛伐他汀由药品生物制品检定所提供。无水乙醇溶解后加入与辛伐他汀等物质的量浓度的NaOH，50℃水浴2h，调pH至7.20，过滤除菌，浓度为10mmol/L，分装后于-20℃保存备用，使用前用RPMI1640稀释后加入培养体系。 RPMI1640培养基购自美国Gibco公司产品,小牛血清购自美国GM公司产品, AnnexinⅤ?FITC试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司,Caspase?3、Caspase?9分光光度试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。

　　1.3细胞培养

　　K562用含10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的RPMI 1640培养基，在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养，每2～3天换液传代培养。

　　1.4细胞形态观察
       
　　取对数生长期细胞，将不同浓度辛伐他汀加入培养体系，培养48h后收集细胞涂片，瑞氏染色后光镜观察细胞形态。

　　1.5AnnexinⅤ?FITC检测细胞凋亡

    收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，实验组加入辛伐他汀，其终浓度分别为5、10、20μmol/L，每个浓度均行3个复孔，同时设阴性对照组，相同条件下培养48、72h。收集各组细胞，4℃预冷的PBS洗细胞两次，结合缓冲液重新悬浮细胞，调节细胞浓度为1×106个/ml。取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin Ⅴ?FITC和10μl 碘化丙锭溶液，混匀后室温避光孵育15min，反应管中加400μl PBS，流式细胞仪检测。

　　1.6Caspase?3、Caspase?9活性测定

    收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，实验组加入辛伐他汀，其终浓度分别为5，10、20μmol/L，每个浓度均行3个复孔，同时设阴性对照，相同条件下培养48h、72h。收集各组细胞，PBS洗涤2次，2 000r/ min离心5min，收集3～5 ×106细胞，用60μl冰冷Lysis Buffer 悬浮细胞，-20℃放置20min，4℃ 10 000r/min离心3min，测定细胞裂解液上清蛋白浓度，并调整蛋白浓度为1.8μg/μl。每孔吸取50μl含90μg蛋白的细胞裂解上清，同时取50μl Lysis Buffer作空白对照。每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT，每孔吸取50μl已配制 2×Reaction Buffer，再加入5μl Caspase?3 Substrate或Caspase?9 Substrate，37℃避光孵育4h，酶标仪测定A405。

　　1.7统计学处理

    所有数据以±s表示，采用SPSS11.0统计学软件分析，多组间均数比较采用单因素方差分析， P<0.05为有统计学意义。

　　2结果

　　2.1细胞形态学变化

    5、10、20μmol/L辛伐他汀作用K562 48h后，光镜下可见典型的凋亡形态学改变，表现为细胞体积缩小,细胞膜完整,胞浆中出现空泡,核染色质浓缩、碎裂成块状弥散在胞浆中，并可见凋亡小体。

　　2.2 辛伐他汀诱导K562细胞凋亡

    AnnexinV/PI双染法是敏感的凋亡检测方法，早期凋亡细胞以AnnexinV?FITC染色为主，晚期凋亡细胞则AnnexinV?FITC/PI双染色。表明辛伐他汀作用K562后，细胞凋亡率显著增高，见表1、图1。表1  辛伐他汀诱导K562细胞凋亡效应（略)注：n=3,与对照组比较*P<0.012.3辛伐他汀活化Caspase?3、Caspase?9

    Caspase?3、Caspase?9活性检测结果如表2所示，10μmol/L，20μmol/L辛伐他汀作用K562细胞48h、72h后Caspase?3、Caspase?9活性明显升高，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01），表明辛伐他汀能活化Caspase?3、Caspase?9。表2  辛伐他汀处理K562细胞后Caspase?3、Caspase?9活性测定结果(略)注：n=3,与对照组比较*P<0.01

　　3讨论

    随着细胞凋亡的深入研究，诱导细胞凋亡的药物不断被发现。流式细胞AnnexinV/PI双染色法利用AnnexinV能与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸特异结合，PI能特异透过死细胞膜使其染色的原理，可将凋亡早期，晚期细胞以及死细胞区分开，是目前常用的细胞凋亡检测方法。本实验用辛伐他汀处理K562细胞，通过流式细胞AnnexinV/PI双染色法证实辛伐他汀能明显诱导K562细胞凋亡。

    在细胞凋亡的机制研究中，目前提出了两条主要信号途径，即线粒体途径和死亡受体途径[6]。Caspase?9是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶，处于Caspase“瀑布式”激活的顶端，它的活化对线粒体凋亡通路的激活尤为重要。Caspase?9酶原经蛋白酶水解成大小亚单位，在细胞色素C，凋亡蛋白酶活化因子?1（Apaf?1）和dATP的参与下形成有活性的二聚体，进一步激活Caspase?3。活化的Caspase?3能裂解DNA修复相关分子、凋亡抑制蛋白、细胞外基质蛋白及骨架蛋白等，促使细胞凋亡。Shellman等[4]研究发现洛伐他汀诱导人黑色素瘤细胞凋亡中有Caspase?3的活化。Wang等[7]研究表明，洛伐他汀诱导HL60细胞凋亡过程中能激活Caspase?3，Caspase?3抑制剂能抑制Caspase活性和DNA片段化。Cafforio等[8]在研究他汀类药物诱导人骨髓瘤MCC?2细胞凋亡中发现，他汀类药物可活化Caspase?3、Caspase?8、Caspase?9，Caspase?9抑制剂能明显降低细胞凋亡率，而Caspase?8抑制剂却不能，表明他汀类药物主要通过Caspase?9活化并进一步激活Caspase?3诱导骨髓瘤细胞凋亡。本研究中，我们以不同浓度辛伐他汀诱导K562细胞凋亡，用分光光度法检测Caspase?3、Caspase?9活性，结果发现辛伐他汀诱导K562细胞凋亡过程中Caspase?3、Caspase?9活性明显增高，提示Caspase?3、Caspase?9参与了辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的调控。辛伐他汀可能通过活化Caspase?9并进一步激活Caspase?3诱导K562细胞凋亡。

【】
  　　［1］Rubins JB,Greatens T,Kratzke RA,et al.Lovastatin induces apoptosis in malignant mesothelioma cells[J].Am J Respir Crit Care Med,1998,157(5 Pt 1)1616?1622.

　　［2］Koyuturk M,Ersoz M,Altiok N.Simvastatin induces proliferation inhibition and apoptosis in C6 glioma cells via c?jun N?terminal kinase[J].Neurosci Lett,2004,370(2):212?217.

　　［３］Wong WW,Tan MM,Xia Z,et al.Cerivastatin triggers tumor?specific apoptosis with higher efficacy than lovastatin[J].Clin Cancer Res,2001,7(7):2067?2075.

　　［４］Shellman YG,Ribble D,Miller L,et al.Lovastatin?induced apoptosis in human melanoma cell lines[J].Melanoma Res,2005,15(2):83?89.

　　［５］Werner M,Sacher J,Hohenegger M.Mutual amplification of apoptosis by statin?induced mitochondrial stress and doxorubicin toxicity in human rhabdomyosarcoma cells[J].Br J Pharmacol,2004,143(6):715?724.

　　［６］Hengartner MO.The biochemistry of apoptosis[J].Nature,2000,407 (12): 770?776.

　　［７］Wang IK,Lin?Shiau SY,Lin JK.Induction of apoptosis by lovastatin through activation of caspase?3 and DNaseII in leukaemia HL?60 cells[J].Pharmacol Toxicol,2000,86(2):83?91.

　　［８］Cafforio P,Dammacco F,Gernone A,et al.Statins activate the mitochondrial pathway of apoptosis in human lymphoblasts and myeloma cells[J].Carcinogenesis,2005,26(5):883?891.