软骨多糖对乳腺癌细胞CyclinD1及p21周期蛋白表达影响的研究
作者：贾永利，张国蓉，刘艳玲，胡延勋，刘安军
【摘要】 ［目的］ 研究软骨多糖对乳腺癌细胞CyclinD1及p21周期蛋白表达的影响。［方法］ 选用MCF-7人乳腺癌细胞系进行体外培养，采用MTT法检测细胞增殖作用，流式细胞仪检测细胞周期的变化，免疫荧光染色方法检测细胞周期蛋白CyclinD1及p21蛋白的表达率。［结果］ 软骨多糖对MCF-7乳腺癌细胞体外生长有明显的抑制作用，且呈时间和剂量依赖性；软骨多糖使MCF-7乳腺癌细胞出现S期阻滞；软骨多糖促进CyclinD1蛋白失表达及p21蛋白过表达。［结论］ 软骨多糖通过影响MCF-7乳腺癌细胞周期蛋白的表达而诱导细胞凋亡，为抗乳腺癌活性物质。
【关键词】 乳腺肿瘤
Impact of Cartilage Polysaccharide on Expression of CyclinD1 and p21 in Breast Cancer Cells
Abstract: ［Purpose］ To study the effect of cartilage polysaccharide on expression of CyclinD1 and p21 in breast cancer cells. ［Methods］ MCF-7 human breast cancer cells was cultured in vitro, cell proliferation effect was measured by MTT assay; cell cycle changes by flow cytometry; expression of CyclinD1 and p21 protein by immunofluorescent assay. ［Results］ Growth of MCF-7 cells in vitro was significantly inhibited by cartilage polysaccharide with a time dependent and dose dependent manner. Cartilage polysaccharide induced cell cycle block in S phase and promoted low expression of CyclinD1 and over expression of p21. ［Conclusion］ Cartilage polysaccharide plays anti-breast cancer effect with inducing apoptosis and changes of cell cycle in breast cancer cells.
Key words: breast neoplasms; cell lines; cartilage polysaccharide; cyclinD1; p21
肿瘤的发生与细胞增殖失控、分化障碍及凋亡受阻密切相关[1]，因此与细胞增殖有关的周期蛋白成为研究癌症发生的热点之一。多糖类化合物是有效的抑癌物质，例如报道的鲨鱼软骨抗癌作用[2]。多糖类化合物具有抑制肿瘤生长及提高免疫力的作用，但大多数局限在植物多糖和真菌多糖，动物多糖的研究相对较少。本实验室以猪软骨提取物——软骨多糖与MCF-7人类乳腺癌细胞为模型进行体外培养，通过观察软骨多糖对乳腺癌细胞周期蛋白Cyclin D1及p21表达的影响，研究软骨多糖的抗肿瘤作用及其抑癌机制。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 软骨多糖的制备
猪的肋软骨用胶体磨磨碎（100目），用0.1N的HCl脱钙2h，蒸馏水洗至中性后，加入1%Na2CO3 70℃加热30min，用木瓜蛋白酶（底物:酶=500∶1）水解3h后，DEAE吸附，NaCl洗脱，得到大分子量的软骨多糖。用3% H2O2降解3h，得到小分子的软骨多糖，用乙醇沉淀，干燥。
1.1.2 药品与仪器
人乳腺癌细胞株MCF-7（天津医科大学惠赠），RPMI-1640培养液（Hyclone公司），EDTA-胰蛋白酶（Gibco），青-链霉素（Gibco），其余试剂均为国产分析纯。酶标仪（Bio-Rid），倒置荧光显微镜（Olympus）。
1.2 方 法
1.2.1 细胞培养
MCF-7培养于10％的新鲜小牛血清，100U/mL青-链霉素的RPMI-1640培养液中，置于5% CO2培养箱，恒温37℃培养。每2~3d换液1次，使用胰蛋白酶消化传代。
1.2.2 细胞增殖抑制实验(MTT法)
选用处于对数生长期的MCF-7细胞，用0.05％胰蛋白酶消化，以2×105个/ml接种于96孔板中,每孔100μl。待贴壁后，分别加入终浓度为50、100、200、400μg/ml的多糖，每孔100μl，每组5个复孔。同时设立对照孔和空白孔。培养24h、48h和72h后，加入MTT工作液（0.5mg/ml）100μl，继续培养4h，吸去溶液，以150μl DMSO溶解结晶物，震荡片刻，用酶标仪测定其在570nm处的吸光度值。抑制率：抑制率=（对照组吸光度值-加药组吸光度值）/对照组吸光度值×100％
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率
常规培养MCF-7细胞，分别用100μg/ml多糖作用12h、24h和48h后，收集1×106细胞，PBS溶液洗涤2次，1 000r/min离心5min。冷乙醇固定，PI染色，应用流式细胞仪分析。
1.2.4 免疫荧光染色技术
常规培养MCF-7，加入终浓度分别为100μg/ml的多糖分别作用24h、48h和72h。细胞滴加兔抗小鼠CyclinD1或p21单抗(1∶100稀释), 湿盒内4℃孵育过夜; 取出后, 恢复至室温, 滴加羊抗兔荧光标记二抗(1∶200稀释)，用封片剂封片后, 在荧光显微镜下观察表达结果。随机选取5个视野1 000个细胞计算阳性表达率。以不加一抗的片子作为阴性对照。
1.2.5 数据分析
采用Excel软件进行数据处理，组间数据采用t检验。
2 结 果
2.1 软骨多糖对MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制作用（MTT）实验
以不同浓度的软骨多糖（50、100、200、400μg/ml），应用MTT法检测其对MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制作用，作用时间分别为24h、48h和72h。从表1可见软骨多糖对MCF-7乳腺癌细胞有较强的抑制作用，并且呈明显的时间相关性和浓度相关性。随着软骨多糖浓度的增加和作用时间的延长，抑制率也随之增加。当应用100μg/ml软骨多糖作用24h后，抑制率为50.21%，因此以后的实验主要采用100μg/ml的软骨多糖进行。
2.2 软骨多糖对MCF-7乳腺癌细胞细胞周期的影响
以浓度为100μg/ml的软骨多糖对MCF-7细胞作用12h、24h和48h后，应用流式细胞仪进行细胞周期方面的检测。从表2可见，软骨多糖作用后的MCF-7细胞出现明显的凋亡峰，且随多糖作用时间的延长，凋亡率有所递增，最大凋亡率可达到33.00％。MCF-7细胞被阻遏于细胞周期的S期，且这种S期积累具有显著的时间依赖性，在多糖作用12h后达到51.15%，24h达到高峰为69.65％，与对照组比较差异有显著性（P<0.01）。实验结果说明软骨多糖通过影响MCF-7细胞的细胞周期而诱导了细胞的凋亡。
2.3 软骨多糖对MCF-7乳腺癌细胞CyclinD1和p21周期蛋白表达的影响
以浓度为100μg/ml的软骨多糖对MCF-7乳腺癌细胞分别作用24h、48h和72h后，应用免疫荧光染色技术检测CyclinD1蛋白以及p21周期表达情况。从表3可以观察到CyclinD1蛋白表达水平随软骨多糖作用时间的增加而降低，同时p21蛋白表达水平随软骨多糖作用时间的增加而升高，与对照组比较差异均有显著性（P<0.01）。实验结果说明软骨多糖通过影响MCF-7细胞的细胞周期蛋白的表达而诱导了细胞的凋亡。
3 讨 论
细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存死亡程序（包括基因）而导致细胞程序化死亡的过程。肿瘤快速增长是由于肿瘤细胞死亡过少及增殖过多的共同结果。许多抗癌药物通过干扰肿瘤的增殖、生长等过程，最终导致肿瘤细胞的程序化死亡，产生细胞凋亡[3]。本实验室提取的软骨多糖能够显著抑制MCF-7乳腺癌细胞的生长并诱导其凋亡，因此通过继续研究软骨多糖对细胞周期蛋白表达的影响来探讨其诱导乳腺癌细胞凋亡的作用机制。
细胞周期的变化是一个复杂的过程，许多蛋白参与调控细胞周期变化。CyclinD1是细胞周期进程的启动子，CyclinD1基因为原癌基因，可与多种癌基因协同促进细胞转化。CyclinD1在乳腺细胞分化中的作用已经在转基因小鼠的研究中得到证实，CyclinD1过度表达，导致乳腺导管细胞增殖，最终产生肿瘤。p21属于细胞周期调控因子，抑制CyclinD1活性，导致细胞周期停止，阻断细胞的增殖过程，对细胞增长起负调控作用[4~8]。本实验研究发现，CyclinD1蛋白在乳腺癌细胞中高表达，达到59.11%。经过软骨多糖作用后的MCF-7乳腺癌细胞CyclinD1表达下降，p21表达上升，并被阻滞在细胞周期的S期。实验结果表明MCF-7乳腺癌细胞可通过抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖，以及调控细胞周期蛋白的表达而影响细胞周期的分布，诱导乳腺癌细胞分化，从而诱导了细胞的凋亡。
综上所述，软骨多糖可能通过CyclinD1的失表达和p21蛋白的过表达而抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡而达到肿瘤的目的，是一种抑癌活性物质。
【】
[1] 王海波, 龚建平, 裘法祖, 等. 人类肿瘤细胞分化中细胞周期素的表达及作用机制[J]. 中华实验外科杂志, 2003, 20(1):39-40.
[2] 王曦, 沈先荣, 贾福星, 等. 鲨鱼软骨提取物对小鼠Lewis肺癌生长的抑制效应[J]. 中华航海医学与高气压医学杂志, 2002, 9(1):51-53.
[3] 吴昊. 细胞凋亡与乳腺癌[J]. 癌症杂志, 1997, 7(2):137-139.
[4] 张强, 田兴松, 余之刚. 乳腺癌中p21基因产物的表达及其临床意义[J]. 山东大学学报, 2002, 40(6):537-539.
[5] Lebeau A,Unholzer A,Amann G, et al. EGFR, HER-2/neu, CyclinD1, p21 and p53 in correlation to cell proliferation and steroid hormone receptor status in ductal carcinoma in situ of the breast[J]. Breast Cancer Res Treat, 2003, 79(2):187-198.
[6] Seewaldt VL,Kim JH, Parker MB, et al. Dystegulated expression of cyclinD1 in normal human mammary epithelial cells inhibits all-transretinoic acid-mediated G0/G1 phase arrest and differentiation[J]. Experimental Cell Res,1999,249(1):70-85.
[7] Wang JJ, Chang YF, Chern YT, et al. Study of in vitro and in vivo effect of 1, 6-Bis[4-(4-arnino-3-hydroxyphenoxy)phenyl] diamantine(DPD), a novel cytostatic and differentiation inducing agent, on human colon cancer cells[J]. Br J Cancer, 2003, 89(10):1995-2003.
[8] Yamamoto H, Ochiya T, Takeshita F, et al. Enhanced skin carcinogenesis in CyclinD1-conditional transgenic mice:CyclinD1 alters keratinocyte response to calcium-induced terminal differentiation[J]. Cancer Res, 2002, 62 (6):1641-1647.
[9] Sutherland RL,Musgrove EA. Cyclins and breast cancer[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2004, 9(1):95-104.
[10] 陈小贺. 细胞周期素D1、p16基因与肿瘤相关性的研究[J]. 实用肿瘤学杂志, 2006, 20(1):76-78.
