TNP

【关键词】  TNP

　　摘要：  目的： 建立裸鼠肺癌骨转移模型，探讨TNP470作为血管抑制剂对肺癌骨转移的形成及生长的影响。方法： 将24只肺癌骨转移裸鼠随机分成三组：第一组隔日予以生理盐水，腹腔注射；第二组隔日腹腔注射3%乙醇；第三组隔日予以TNP470 30mg/kg腹腔注射。30天后处死，检测血清碱性磷酸酶、血管内皮生长因子（VEGF）和肿瘤微血管密度（MVD），HE染色后光镜下观察各组肿瘤组织,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果： TNP470组肿瘤的生长明显受到抑制，肿瘤组织中的MVD与对照组比较显著降低，抑瘤率为36.5%，凋亡指数上升，血清碱性磷酸酶下降。结论： TNP470能够明显抑制裸鼠肺癌骨转移瘤的生长和新生血管形成。

　　关键词：  TNP470；  肺癌骨转移；  血管生成抑制剂   

　　肺癌晚期常会出现各种部位的转移，其中以骨转移最为常见，骨转移的发生率为20%~40%。骨转移早期无任何症状，晚期则表现为局部的顽固性疼痛，并有固定的压痛点。骨转移可导致骨质溶解、高钙血症及病理性骨折等多种并发症，其传统方法有化疗、放疗及放射性核素治疗等。抗血管生成治疗作为一条新的治疗肿瘤思路已被大多数学者所公认［1］。TNP470是一种烟曲霉素类似物，其对内皮细胞增殖的抑制作用较烟曲霉素强50倍以上，并能抑制多种鼠肿瘤细胞系的体外增殖和实体瘤的生长。TNP470单独应用对肺癌骨转移瘤生长影响的研究还未见报道，本实验对此进行初步探讨。

　　1  材料和方法

　　11  药剂与动物

　　TNP470由日本Osaka Takeda化学公司提供，用无水乙醇3ml溶解，97ml生理盐水稀释。BALBC裸鼠，鼠龄4周，雌雄兼备，体重15~20g，在SPF环境中饲养。

　　12  肺癌骨转移动物模型建立

　　A549单细胞悬液用1640培养基(pH7.0)加15%小牛血清于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养，注射前PBS洗净,并调节细胞浓度到1×107个/ml。裸鼠乙醚吸入麻醉后用75%酒精消毒股骨及胫骨处皮肤，取19G针头直接于骨性粗隆上刺透骨皮质,然后将针尖插入骨干内注入0.1ml的单细胞悬液。注射完后饲养于动物实验中心。

　　13  动物分组与体内实验

　　接种后的24只裸鼠均成瘤，将其随机分为3组，每组8只，各组裸鼠体重差异无显著性。①第一组（对照组）：隔日腹腔注射生理盐水；②第二组（溶剂组）：隔日腹腔注射3%的乙醇；③第三组（TNP470组）：隔日腹腔注射TNP470 30mg/kg。注射时均为等量液体，于接种30天后断颈处死全部裸鼠，处死之前均摘眼球放血以检测血清碱性磷酸酶的含量；脊椎离断处死后剥出肿瘤组织，称重，测量肿瘤长径和短径，按以下公式瘤体积和抑瘤率。

　　肿瘤体积（mm3）=π/6×a×b2（a为长径,b为短径）

　　抑瘤率=（V1-V2）/V1×100%（V1为对照组肿瘤体积，V2为实验组肿瘤体积）

　　14  各组肿瘤组织内MVD、VEGF表达及结果判断

　　肿瘤组织置于10%中性甲醛中固定24小时，石蜡包埋，组织切片（4μm），进行免疫组化染色。VEGF和MVD染色均采用SABC法，以PBS代替一抗作阴性对照。VEGF判断标准：高倍镜视野下计数100个细胞，胞浆棕黄的阳性细胞＜5%为阴性，≥5%为阳性。采用German KonTKON IBSA2.5全自动图像分析系测定肿瘤组织中VEGF的平均灰度和象素面积。MVD判断标准［2］：凡与临近的肿瘤细胞、微血管或结缔组织分开的，呈棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞串计为一个血管，但肌层较厚或管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。

　　15  流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡

　　肿瘤组织采用EDTA螯合法制备成单细胞悬液后PI(浓度为100mg/L)染色，应用EPICS  ALTRAⅡ型流式细胞仪(美国Beckman公司产品)作细胞周期分析。

　　16  统计学处理

　　所有数据采用均数±标准差（±s）表示，P＜0.05表示有显著性差异，数据采用SPSS10.5统计软件进行单向方差分析。

　　2  结果

　　21  各组鼠重、瘤重及肿瘤体积大小

　　对照组及实验组肿瘤生长情况见图1。接种后两组裸鼠瘤体积逐渐增大，对照组肿瘤体积14天后增长明显；TNP470组则增长缓慢， 20天后肿瘤几乎处于停滞状态，体积无明显变化。实验结束时各组鼠重、瘤重、肿瘤体积见表1。裸鼠体重方面：术后3天称重，三组中均有部分裸鼠体重下降，但到术后6天都基本恢复到术前水平。接种后23天左右，对照组部分裸鼠体重下降、消瘦、行动迟缓；而TNP470组大部分裸鼠均有体重下降的表现，其活力却未见明显受限。瘤重方面：治疗组的瘤重和瘤积与对照组比较均有显著差异（P＜0.01）。

　　图1  对照组及TNP470组肿瘤对比 （略）                                                

　　表1  实验组与对照组鼠重、瘤重及肿瘤体积（略）

　　注：* P＜0.05, ** P＜0.01。

　　22  各组肿瘤组织VEGF、MVD的表达

　　血管内皮生长因子VEF主要表达于肿瘤细胞的胞浆和胞膜中，呈棕黄色。TNP470组与对照组比较，VEGF表达减少，有差异显著性。所有肿瘤组织内MVD均阳性表达，内皮细胞被染成棕黄色，微血管的大小形态差异较大，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇，有的细胞不明显或形态不规则。TNP470组和对照组比较，MVD显著减少，见表2。这表示，TNP470能明显抑制肿瘤血管生成和MVD的水平。

　　表2  肿瘤组织中VEGF和MVD的水平（略）

　　注：* P＜0.05（F=11.58）； # P＜0.01（F=16.76）。

　　23  肿瘤细胞凋亡率

　　对照组的平均凋亡率为（3.97±2.81）%；TNP470组肿瘤细胞出现较为明显的凋亡峰，S期细胞减少，G1期细胞增加，平均凋亡率为（27.64±5.24）%，较对照组明显升高（P＜0.01）。见图2、3。

　　图2  对照组肿瘤细胞凋亡曲线 （略）                                                

　　图3  TNP470组肿瘤细胞凋亡曲线 （略）                                                

　　24  血清碱性磷酸酶水平

　　对照组的平均碱性磷酸酶值为（24.82±3.79）U/L，TNP470组的平均碱性磷酸酶值为（16.27±2.96）U/L，较对照组明显降低（P＜0.05）。

　　25  光镜下肿瘤细胞形态

　　对照组光镜下可见肿瘤细胞大小不均、分裂活跃、细胞核大、核浆比例严重失调、瘤巨细胞较多，视野内退化的肿瘤细胞和渗出的炎性细胞极少见；而TNP470组视野内退化的肿瘤细胞显著增加,可见散在的各种渗出的炎性细胞,视野内见到肿瘤细胞核固缩,染色质凝集等肿瘤细胞退化表现，瘤细胞密度相对生理盐水组也有显著下降。

　　3  讨论

　　体外实验已证实TNP470对血管内皮细胞增殖有极强的抑制作用，而体内实验也不断发现它可控制多种肿瘤在动物体内的生长和转移。本实验结果显示，与对照组相比，TNP470组肿瘤的生长速度明显减慢，20天后几乎处于停滞状态，最后的重量和体积明显减少，免疫组化表明TNP470组的VEGF和MVD表达较对照组明显降低，这说明TNP470具有抑制肿瘤组织新生血管的作用。同时，我们还发现TNP470组的肿瘤细胞凋亡率较生理盐水组显著升高，提示TNP470能通过促使肿瘤细胞凋亡来发挥抑制肿瘤生长的作用，这与Yamaoka［4］及Ohta［5］等的实验结果一致。实验中给药组的平均碱性磷酸酶值降低明显，表明组的转移瘤骨破坏较少。1998年Sasaki A［6］等也发现TNP470不但能通过抑制肿瘤新生血管形成来抗肿瘤,而且它还能抑制乳腺癌骨转移灶的溶骨性骨吸收。

　　本实验中,给药结束时动物体重较给药前显著下降,而对照组在实验前后无明显变化，这种体重的变化可能是由于TNP470的副作用所致［7］。我们推测TNP470可能通过多种因素来发挥抗肿瘤作用，比如:通过抑制肿瘤新血管形成发挥抗癌作用；通过阻滞内皮的增生、移动、管道形成而抑制新血管形成；通过对内皮细胞增殖周期的影响而抑制血管形成等。

　　近10年来血管生成作为肿瘤治疗的新途径方面的研究很快，但我们对抗血管生成在肿瘤治疗中的地位应该有一个理性和的认识。几年前，由于一些缺乏科学性的宣传，抗血管疗法的前景被过分夸大，甚至有人断言肿瘤将会因此在5年内被攻克。从理论上讲，血管生成不可能成为人类彻底攻克肿瘤的突破口，而临床试验结果也表明抗血管生成药物远没有人们所期望的那么有效。但我们也应该认识到抑制血管生成是肿瘤治疗理论上的一个突破，它以肿瘤内的正常细胞而不是瘤细胞本身作为治疗靶点，开拓了治疗肿瘤的新思路，并为临床提供了又一条可供选择的治疗途径和一些新的药物。因此，我们可以将TNP470与其它化疗药物联合应用作为下一步研究的工作重点。

　　1  Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications. N Engl J Med, 1971, 285(20): 1182~1186.

　　2  Weidner N. Tumor angiogenesis: Review of current application in tumor prognosis. Semin Diagn pathol, 1999, 10(4): 302~313.

　　3  Ingber D, Fujita T, Kishimoto S, et al. Synthetic analogues of fumagillin that inhibit angiogenesis and suppress tumour growth. Nature, 1990, 348(6): 555~557.

　　4  Yamaoka M, Yamamoto T, Ikeyama S, et al. Angiogenesis inhibitor TNP470 (AGM1470) potently inhibits the tumor growth of hormoneindependent human breast and prostate carcinoma cell lines. Cancer Res, 1993, 53(21): 5233~5236.

　　5  Ohta Y, Watanabe Y, Tabata T, et al. Inhibition of lymph node metastasis by an antiangiogenic agent, TNP470. Br J Cancer, 1997, 75(4): 512~515.

　　6  Sasaki A, Alcaide RE, Nishiyama A, et al. Angiogenesis inhibitor TNP470 inhibits human breast cancer osteolytic bone metastasis in nude mice trough the reduction of bone resorption. Cancer Res, 1998, 58(1): 462.

　　7  Kato T, Sato K, Kakinuma H, et al. Enhanced suppression of tumorgrowth bycombination of angiogenesis inhibitor O(chloroacetylcarbamoyl) fumagillol (TNP470) and cytotoxic agents in mice. Cancer Res, 1994, 54(19): 5143~5147.