川芎嗪抗实验性肝纤维化组织中TGF-β1阳性面积率表达的比较

       作者：吴建红 陕 光 张端莲 叶庆斌 郑承庆 熊烈

【关键词】  川芎嗪

　　摘 要:  目的: 观察川芎嗪对大鼠实验性肝纤维化作用的效果。方法: 采用四氯化碳（CCL 4   ）诱导大鼠肝纤维化模型，将  实验动物随机分为正常对照组（N）5只、肝纤维化模型组（H）20只、川芎嗪治疗组（TMP）20只，除正常对照组以外其它两组均给予  40% 四氯化碳（CCL    4   ）花生油溶液0.3ml/100g腹腔注射，每周2次，共6周。川芎嗪组于肝纤维化模型建立后给予盐酸川芎嗪  （TMP）60mg/ kg 经口灌胃，1次/d，连续治疗60天;其余两组同时给予同等剂量的生理盐水。于60天后分别处死各组大鼠。用免疫  组织化学方法染色观察肝组织中转化生长因子β1（TGF-β1）表达的变化，并利用机图像分析技术测量正常对照组、肝纤维化模  型组及川芎嗪治疗组TGF-β1表达的平均阳性面积。结果:免疫组织化学S-P法染色显示TMP能明显抑制肝组织中TGF-β1水平的  表达， TGF-β1在川芎嗪治疗组中的表达明显低于肝纤维化模型组， TGF-β1在川芎嗪治疗组与肝纤维化模型组之间有显著性差异（ P   <0.01）; TGF-β1在川芎嗪治疗组与正常对照组中呈高表达， TGF-β1在川芎嗪治疗组与正常对照组之间差异无显著性（ P >0.05）。  结论: 川芎嗪对四氯化碳（CCL   4   ）诱导的大鼠实验性肝纤维化有明显的保护和治疗作用。  

　　关键词:  川芎嗪; 肝纤维化; 转化生长因子β1（TGF-β1）; 免疫组织化学; 阳性面积

　　肝脏由肝的实质细胞和非实质细胞构成， 实质细胞系指  肝细胞（HC） ， 而非实质细胞包括窦内皮细胞（SEC）、枯否氏  细胞（KC）、肝星状细胞（HSC） 和陷窝细胞（pit cell） ， 这些细  胞经研究表明均以不同方式参与肝纤维化（LF）的形成。  肝纤维化是各种慢性肝病至肝硬化的必由之路，部  分甚至发展为肝癌，目前仍然缺乏有效的抗纤维化的治疗。  寻找有效的抗肝纤维化的药物是目前临床研究的一个热点。  川芎嗪是中药川芎的有效成分，对肝细胞具有保护作用，具有  一定的阻抑肝纤维化作用。本研究用免疫组织化学方法染色  观察肝组织中转化生长因子β1（TGF-β1）表达的变化，并利用  计算机图像分析技术测量正常对照组、肝纤维化模型组及川  芎嗪治疗组TGF-β1表达的平均阳性面积，观察川芎嗪对大鼠  实验性肝纤维化作用的治疗效果，并探讨其作用机制。 

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 

　　1.1.1  试验动物 Wister雄性大鼠（SPF级）45只，体重280  ～360g， 由武汉大学医学院动物试验中心提供。食用标准大  鼠饲料， 饮自来水， 室温22℃。

　　1.1.2  大鼠肝纤维化模型制备及药物应用 将40只大鼠随  机分成2组，川芎嗪组20只，对照组20只。另设正常对照组  5只。除正常组以外其它两组均给予40%四氯化碳（CCL    4   ）  花生油溶液0.3ml/100g腹腔注射，每周2次，共6周。川芎嗪  组于肝纤维化模型建立后给予盐酸川芎嗪（TMP）60mg/ kg 经  口灌胃，1次/d，连续治疗60天;其余两组同时给予同等剂量   的生理盐水。于60天后分别处死各组大鼠，取其新鲜肝脏方  叶小块组织，10% 中性甲醛中固定，常规HE染色观察肝脏组  织学改变。

　　1.2  试剂与仪器

　　1.2.1  主要试剂 ① 浓缩型鼠抗人TGF-β1多克隆抗体（北  京中山生物技术有限公司）;② 超敏即用型S-P通用型免疫组  织化学试剂盒（福州迈新公司）;③ DAB显色试盒及多聚赖氨  酸（北京中山生物技术有限公司）。   1.2.2  主要仪器 ① YWY781B医用微波仪为浙江临安  器材厂生产;② 电热恒温干燥箱为湖北省黄石市医疗器械厂  生产;③ 低温冰箱为广州容声冰箱厂生产;④ 显微镜成像系  统为日本奥林巴斯公司产品。

　　1.3  实验方法

　　免疫组织化学染色S-P法检测TGF-β1，具体步骤如下:  ① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;② 3%过氧  化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗  4×5min;③ TGF-β1采用微波抗原修复（3档，10 min）， PBS  洗4×5min;④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性  反应;⑤ 一抗（TGF-β1，1:40 ）37℃孵育1 h，PBS洗4×5min;  ⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑦   链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，  PBS洗4×5min;⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应;  ⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。  用PBS代替一抗作为阴性对照组。

　　1.4  免疫组织化学结果判断

　　TGF-β1以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照  组除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。  采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统  （同济千屏影像公司）对TGF-β1表达进行定量分析，每张切片  随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个  视野下阳性反应的阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳  性面积率。以每例5个视野的阳性面积率的平均值作为该例  的测量值。  阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积  中细胞的总面积×100%。

　　1.5  统计学处理

　　对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的阳性面积率作单因  素方差分析和SNK- q 检验，检验水准 α 为0.05。  

　　2  结果 

　　川芎嗪组肝细胞胞浆呈浅黄色或蓝色，胞浆内也无  棕黄色颗粒沉积，TGF-β1呈弱阳性或阴性表达;肝纤维化模  型组胞浆内可见较多棕黄色颗粒，TGF-β1呈强阳性表达。图  像分析结果显示:正常对照组TGF-β1表达的阳性面积率为1.  326;川芎嗪治疗组TGF-β1表达的阳性面积率为1.338;肝纤  维化模型组TGF-β1表达的阳性面积率为4.028。经单因素方  差分析，组间有显著性差异（ P<0.01）。经q 检验，正常对照  组与肝纤维化模型组之间、川芎嗪治疗组与肝纤维化模型组  之间，TGF-β1的阳性面积率有显著性差异（ P <0.01）;正常对  照组与川芎嗪治疗组之间TGF-β1阳性面积率的差异无显著  性（ P >0.05）。见表1。    表1 各组肝组织中TGF-β1表达的比较注:* 正常对照组与肝纤维化模型组比较， P <0.01;# 肝  纤维化模型组与川芎嗪治疗组比较， P<0.01;## 川芎嗪治疗  组与正常对照组比较，P >0.05。

　　3  讨论

　　肝纤维化是消化系统的一种常见病、多发病，也是肝硬化  的前期病理阶段，是由于各种慢性肝损伤引起的肝脏细胞外  基质（ extra cellular matrix， ECM） 合成增加和（或）降解减少  的结果，是慢性肝病重要的病理特征，也是进一步向肝硬化发  展的必经之路。其发病机制复杂，治疗效果不十分令人满意，  甚至部分肝纤维化可发生癌变，严重影响和威胁人民身体健   康。积极探索肝纤维化发病机制，寻求有效治疗措施对降低  肝硬化发病率和死亡率具有重要意义。实验研究表明，在肝  纤维化阶段进行干预，病变是可以逆转的。  有研究报导，川芎嗪具有较强的抗纤维化作用，认为许多  细胞的增殖与细胞内的Ca    2+   和钙调素（CaM ）有关    ［1～3］    ，已经  发现钙通道和CaM阻滞剂可显著地抑制培养的人胚肺成纤维  细胞的增殖。研究证实，川芎嗪可降低博菜霉素所致鼠肺纤  维化组织钙含量及钙调素活性，防治鼠肺纤维化。  TGF-B是它是一种强有力的致纤维化因子    ［4～6］    。肝纤维  化的主要原因在于肝损伤期间细胞外基质（extracellularm ix-  true， ECM）沉积与降解的动态平衡被打破，而ECM的合成和  降解过程很大程度上由TGF-B控制。本研究结果表明: 正常  对照组肝组织间质内胶原纤维结构中，TGF-β1呈弱阳性或阴  性表达;川芎嗪治疗组肝组织间质内胶原纤维结构中，TGF-β1  呈弱阳性或阴性表达;肝纤维化模型组肝组织间质内胶原纤  维结构中，TGF-β1呈强阳性表达。经单因素方差分析，组间  有显著性差异（ P<0.01）。经q 检验，正常对照组与肝纤维化  模型组之间、川芎嗪治疗组与肝纤维化模型组之间，TGF-β1  的阳性面积率有显著性差异（ P <0.01），正常对照组与川芎嗪  治疗组之间TGF-β1阳性面积率的差异无显著性（ P >0.05）。  肝纤维化模型组肝细胞胞浆内有密集分布的棕黄色颗粒，  TGF-β1呈强阳性表达，提示TGF-B能促进胶原纤维的合成。  TGF-B主要通过促进ECM的合成与沉积及其抑制ECM的降  解来参与肝纤维化的发生。本实验结果尚显示，川芎嗪治疗  组肝细胞胞浆内无棕黄色颗粒分布，TGF-β1呈弱阳性或阴性  表达，提示川芎嗪能抑制胶原纤维的合成，保护肝细胞，从而  减轻和抑制了肝纤维化。

　　参 考 文 献 

　　1 A.B. Sutton . The response of endothelial cells to TGF-β1 is depend-  ent upon cell shape ，proliferative state and the nature of the substralum.   J. Cell Science，1991，99（3）:777～787.

　　2 Yoshinari Myoken. Bifunctional effects of transforming growth factor-β  （TGF-β） on endothelial cell growth correlate with phenotypes of TGF-β  binding sites. Exp. Cell Res. 1990，19（1）:299～304.

　　3 Luis F. Fajardo， Transforming growth factor-β1 induces angiogenesis in   vivo with a threshold pattern. Lab Invest .1996，74（3）:600～608. 

　　4 Fausto N. Multifunctional roles for transforming growth factor-B1. Lab   Invest，1991，65:497. 

　　5 L aurance D A. TGF-B: an overview. Kidney Int， 1995，47: 519.

　　6 A rmendariz， Borunda J，Seyer J M，et al.Regulation of TGF beta gene   expression in rat liver intoxicated with carbon tetrarch- loride. FA SEB J   ，1990，4:215.