反相高效液相色谱法测定全血中环孢素A的浓度
【关键词】 反相高效液相色谱法;环孢素A;血药浓度监测
［摘要］目的: 建立检测患者全血中环孢素A（CsA）浓度的高效液相色谱法。 方法: 血样经乙醚-石油醚（70∶30）萃取后，以C 18 硅胶键合相为固定相，乙腈-甲醇（80∶20）为流动相，70℃柱温下进行色谱分析，紫外检测波长为210nm。 结果: CsA全血浓度在50～1600ng.mL范围内呈良好的线性关系，r=0.9998，方法的平均回收率为97.6%，日内和日间精密度RSD均小于6%（n=5），最低检测限为10ng.mL。 结论: 本法简便、快速，易于开展，用于肾移植术后患者CsA的血药浓度监测，效果良好。
［关键词］ 反相高效液相色谱法;环孢素A;血药浓度监测
Determination of cyclosporin A in human whole blood by RP-HPLC
18 column and a mobile phase of acetonitrile-methanol（80∶20）.The column temperature was maintained at70℃and CsA was detected at210nm.Results:A good linear relationship was obtained between the con-centration of CsA from50ng.mL to1600ng.mL，r=0.9998.The average recovery rate of CsA was97.6%，and the RSD within a day and be-tween days were less than6%（n=5）.The detection limit of CsA was10ng.mL.Conclusions:The established method was accurate，simple，sensitive and suitable for the therapeutic monitoring of CsA.
［Key words］RP-HPLC;Cyclosporin A;Therapeutic drug monitoring
环孢素A（Cyclosporin A，CsA）是一种选择性的免疫抑制剂，广泛用于器官移植疾病及其它疾病［1，2］ 。由于CsA体内过程的个体差异较大，其血药浓度过高或过低都会引起毒副反应，因此在患者治疗过程中需常规监测血药浓度，从而提高移植器官或组织的存活率并降低对肾脏和肝脏的毒副作用［3］ 。目前国内外测定全血中CsA的方法主要有荧光偏振免疫法（FPIA）和高效液相色谱法。FPIA法因简便、快速而受到临床欢迎，但其测定成本昂贵，且该法易受代谢产物等因素的干扰，使测定结果偏高;HPLC法有固相萃取法和液-液多步萃取法 ［4、5］ ，操作较繁琐，但成本较低。为此，本文建立了一种简便可行的RP-HPLC法测定CsA全血浓度，用于肾移植术后患者CsA血药浓度监测，效果良好。
1 材料和方法
1.1 仪器
高效液相色谱仪（美国Waters公司，510型泵，486型紫外检测器）;色谱柱恒温箱（天津金州仪器公司，AT-130），快速混匀器（江西医疗仪器厂，YHK型）;台式离心机（上海安亭科学仪器厂，KDC-16H）;微量分析天平（美国TG322A）。
1.2 试剂与药品
CsA和CsD标准品（药品生物制品检定所，0668-0203、0669-0206），乙腈、甲醇为色谱纯（美国Dik-mapure，20050318、20050116），其他试剂为分析纯。
1.3 标准溶液的配制
精密称取CsA标准品8mg，用甲醇溶解并定容于100mL容量瓶（80μg.ml）得贮备液，保存于-20℃冰箱中。精密称取CsD标准品5mg，用甲醇定容至100mL容量瓶中，配制成贮备液，取CsD储备液4mL用甲醇稀释至100mL容量瓶，配制成2000ng.mL的内标工作液。
1.4 色谱条件
固定相:Nova-Pak C 18 柱（4μm，3.9mm×150mm）（美国Waters仪器公司），柱温:70℃;流动相:乙腈-水（80∶20），流速:0.8mL.min;检测波长:210nm;灵敏度:0.005AUFS。
1.5 样品处理
0.5mL血样中加100μL内标工作液，旋涡混匀后，加入150μL250mmol.L的氢氧化钠液，旋涡混匀后置45～50℃水浴孵育约5min破坏RBC，再混匀后，加3mL石油醚-乙醚（70∶30），旋涡提取8min，3000r.min离心3min，分离有机层于尖底试管，于45～50℃水浴通氮气吹干，再加300μL甲醇溶解后，分别用1mL正己烷-正庚烷（50∶50）反萃取两次后，1500r.min离心3min后吸弃上层液，于45～50℃水浴通氮气吹干，残渣用50μL甲醇充分溶解，按“色谱条件”项下条件进样 20μL分析。
2 结果
2.1 方法可行性
在所选色谱条件下，CsA及内标CsD能较好的分离（CsA、CsD的保留时间分别为7.25min、9.30min），分离度R=1.602，色谱峰与内源性杂峰分离良好，易准确定量。色谱图见图1。 A:空白血样 B:空白血样+CsA C:空白血样+内标 D:空白血样+CsA+内标 E:患者血样图1 血液中环孢素A的HPLC图（1-CsA 2-内标）
2.2 标准曲线的绘制
取空白全血加入CsA标准溶液，配制成相当于血中CsA浓度分别为50、100、200、400、800、1600ng.mL的样品，按“样品处理”项下操作，进样测定，内标法定量，以CsA峰高与内标峰高比值（Y）对浓度C进行线性回归，CsA在50～1600ng.mL浓度范围内线性方程为:Y=0.0030C+0.0046，r=0.9998，表明线性关系良好。本法最低检测限为10ng.mL（按信噪比3∶1计）。
2.3 回收率、精密度试验
取空白全血分别加入CsA标准溶液，使其浓度分别为100、300、600ng.mL，按“样品处理”项下操作，测定血药浓度，平均回收率97.6%，结果见表1。 取空白全血分别加入CsA标准溶液，使其浓度分别为100、300、600ng.mL，按“样品处理”项下操作，重复测定5d，日内测定5次，计算日内及日间重复性，平均RSD分别为2.48%、4.41%，结果见表1。表1 CsA血样回收率和精密度
2.4 方法的专属性
我们将肾移植患者常用药物如醋酸泼尼松、硫唑嘌呤、骁悉、地尔硫 艹卓 、硝苯地平等加入空白全血中，按“样品处理”项下操作，进样分析，结果在10min前未见恒定峰出现，因此可证实上述药物均不干扰测定。
2.5 临床应用
2000年1月～2006年3月，我们用该法监测肾移植术后患者CsA血样共508例次，其中CsA浓度低于100ng.mL24例次，100～400ng.mL406例次，大于400ng.mL77例次，分别占总例次的4.8%、80.0%及15.2%。CsA浓度低于100ng.mL及高于400ng.mL的患者，多伴有肝肾功能检查结果异常及肝肾功能损害的临床体征，提示因CsA浓度偏低发生排斥反应或CsA浓度过高引起肝肾中毒，经及时调整患者CsA剂量，获得良好临床疗效。
3 讨论
CsA的代谢物达20多种，HPLC法测定CsA为原形药物浓度，其结果不受代谢物影响，而FPIA法测定则为原形药物和代谢物总量，因此，测得的血药浓度会高于HPLC法。由于CsA的代谢物毒性目前还不清楚，而且代谢方式根据不同患者（不同疾病、不同）而有差异，因此，HPLC法测定值与药理效应之间具有更好的量效关系。本法建立的HPLC法准确性高，专一性强，变异性小，回收率高。
本法使用价格比较低廉的石油醚、正己烷为萃取添加剂，其对CsA的萃取与纯用乙醚、正庚烷相似，但成本大大降低，更易排除杂质［6］ 。
对CsA全血浓度测定的样品预处理，近几年报道有固相萃取法［7］ 、液-液多步萃取法［8］ 、液-液单步萃取法［7，8］ ，前二种方法操作较复杂，且耗时过多，不符合临床检测的要求，而选用液-液单步萃取法处理样品就大大简化了操作，节省了时间。
:
［1］沈 宏，卢一平，唐科士，等.肾移植患者停用环孢素A后近期急性排斥及安全停用环孢素A临床研究［J］.中华器官移植杂志，1997，18（2）:114.
［2］孙成春，郝俊文，王景祥.肾移植术后监测环孢菌素A血药浓度与THP的临床意义［J］.临床药学杂志，1997，6（4）:150.
［3］范洪伟，杨 军，郑法雷，等.环孢霉素A与其它药物间 的相互作用［J］.国外医学泌尿系统分册，1994，1（5）:193.
［4］刘锡钧，陶其海，陈焕新，等.反相高效液相色谱法测定环孢霉素全血浓度及药代动力学［J］.药学学报，1988，23（5）:397.
［5］陶其海，刘锡钧，云毅祥.正相高效液相色谱法测定环孢 菌素A全血浓度［J］.药物分析杂志，1993，13（2）:93.［
6］刘定勇，邹远高，梁茂植，等.改良高效液相色谱法监测 肾移植患者环孢霉素A的全血浓度［J］.华西医科大学学报，1995，26（4）:455.
［7］田辉凯，徐凯建，樊宏伟.固相萃取-反相高效液相色谱法测定全血环孢素A［J］.中国药学杂志，1999，19（2）:275.
［8］张毕奎，李焕德，刘燕相，等.单步萃取高效液相色谱法测 定全血环孢素A浓度及在肝、肾移植患者中的应用［J］.中国临床药学杂志，1999，8（6）:357.
