梯度洗脱HPLC法测定头孢唑肟钠的有关物质

【摘要】  目的 建立梯度洗脱HPLC法测定头孢唑肟钠的有关物质。方法 采用Diamonsil C18(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用1mol/L磷酸调pH为4.0)为流动相A，甲醇∶乙腈∶水(250∶200∶50)为流动相B，梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长254nm，柱温35℃。结果 头孢唑肟在1.0～31.7μg/ml范围内，浓度与峰面积呈良好线性关系，r=0.9999。结论 本法简便，准确，可定量测定头孢唑肟钠的有关物质。

【关键词】  梯度洗脱HPLC 头孢唑肟钠 有关物质

    Determination of related substances in ceftizoxime sodium

    ABSTRACT  Objective  To establish a gradient elution HPLC method to determine the related substances of ceftizoxime sodium.  Method  Diamonsil C18 (4.6mm×150mm, 5μm) column was used. The mobile phase consisted of 0.01mol/L potassium dihydrogen phosphate solution (pH adjusted to 4.0 with 1mol/L phosphoric acid) as mobile phase A and methanol∶acetonitrile∶water (250∶200∶50) as mobile phase B. Gradient elution was used. The flow rate was 1.0ml/min. The detection wavelength was 254nm. The column temperature was 35℃.  Results  The calibration curves was linear within the range of 1.0～31.7μg/ml for ceftizoxime (r=0.9999).  Conclusion  This method was simple and accurate for determination of related substances in ceftizoxime sodium.

    KEY WORDS  Gradient elution HPLC;  Ceftizoxime sodium;  Related substances

    头孢唑肟钠是日本藤泽药品株式会社开发的半合成第三代头孢菌素，具广谱抗菌作用，对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌产生的广谱β?内酰胺酶(包括青霉素酶和头孢菌素酶)稳定，对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形菌等肠杆菌科细菌有较好的抗菌作用，临床用于急性、中度呼吸系统感染和泌尿系统感染［1，2］。现已有多个国家的头孢唑肟钠原料进口，国内已有制剂产品上市。《药典》2005版二部未收载头孢唑肟钠原料的质量标准，USP29版［3］和JPⅩⅣ［4］均有收载，但USP29版未对有关物质进行要求，JPⅩⅣ则采用反相HPLC法同时进行含量测定和有关物质检查。为有效控制产品质量，对生产、运输及贮藏过程中可能产生的有关物质进行控制，本文参照有关资料，采用梯度洗脱HPLC法测定头孢唑肟钠的有关物质，取得满意结果。

    1  仪器与试药

    岛津LC?10AT高效液相色谱仪，岛津SPD?10A紫外可见分光光度检测器，CBM?10A数据处理机，7725型进样阀等；头孢唑肟钠原料(含量958μg/mg)及对照品(纯度998.1μg/mg)均由印度Orchid公司提供；甲醇和乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾和磷酸氢二钠为分析纯，水为去离子水经Milli?Q plus纯水器处理。2  色谱条件

    色谱柱：Diamonsil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相A：0.01mol/L磷酸二氢钾(用1mol/L磷酸调pH为4.0)，流动相B：甲醇∶乙腈∶水(250∶200∶50)；流速1.0ml/min，梯度洗脱程序见Tab.1；检测波长254nm；柱温35℃；进样量10μl。

    3  方法与结果

    3.1  方法的专属性考察

    酸破坏  取头孢唑肟对照品1mg，置10ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液1ml溶解，静置5min，用磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾3.63g，磷酸氢二钠10.73g，加水溶解并稀释至1000ml，pH7.0)稀释至刻度，摇匀。

    碱破坏  取头孢唑肟对照品约1mg，置10ml量瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml溶解，静置5min，加磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释至刻度，摇匀。

    加热破坏  取供试品溶液(1mg/ml)适量，置60℃水浴加热30min，冷却。

    光照破坏  取供试品适量，置254nm光照射6h后精密称取适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)制成每1ml中约含1mg的溶液。

    分别取上述溶液进样，记录色谱图，结果头孢唑肟钠经酸、碱、加热、光照等破坏，所产生的杂质峰与主成分峰均能达到有效分离，表明方法的专属强。选择碱破坏溶液作为方法的系统适用性溶液(Fig.1)。

    3.2  方法的耐用性考察

    选用大连依利特Hypersil、资生堂Capcell Pak MGII、Phenomenex Synergi和Dikma Diamonsil  色谱柱等4种不同品牌、不同填料的C18色谱柱，取系统适用性溶液分别进样，结果4种色谱柱无论是已知杂质峰或未知杂质峰与主成分峰均能达到有效分离，且各峰的出峰顺序相同。

    3.3  线性与范围

    取头孢唑肟对照品适量，精密称定，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解并稀释制成浓度为1.05、2.11、5.29、10.58、21.16和31.74μg/ml的溶液，分别进样，记录色谱图。以浓度(Y)对峰面积(X)进行线性回归，回归方程：

    Y=5.23×10-5X+0.1002  r=0.9999

    头孢唑肟在1.0～31.7μg/ml范围内呈良好线性关系。

    3.4  检测限和定量限

    检测限按信噪比3∶1计为0.003μg/ml，定量限按信噪比10∶1计为0.01μg/ml。

    3.5  精密度试验和稳定性试验

    精密称定头孢唑肟钠供试品适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解并稀释制成每亳升含1mg的溶液，重复进样6次，总杂质峰面积的RSD为6.1%(n=6)(按外标法以峰面积，总杂质含量为0.18%)，表明本法的重复性良好，适合测定杂质含量［5］。取上述溶液，分别放置0、2、4、8和10h进行测定，结果供试品溶液在4h后杂质峰面积有增加的趋势，表明供试品的水溶液较不稳定，有关物质检查用的溶液应配制后立即进样测定。

    3.6  供试品测定

    精密称定头孢唑肟对照品适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解并稀释制成每亳升含10μg的溶液为对照品溶液；取供试品适量，精密称定，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解并稀释制成每亳升含1mg的溶液为供试品溶液。取对照品溶液进样，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%。另取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液进样，记录色谱图，供试品溶液色谱图见Fig.2，按外标法以峰面积计算，任意单个杂质不得过0.5%，总杂质不得过2.0%。

    3.7  结果比较

    采用本文方法和JPⅩⅣ版方法对3批样品的有关物质进行测定，结果见Tab.2。

    4  讨论

    (1)JPⅩⅣ版采用等度洗脱HPLC法同时进行含量测定和有关物质检查，从Tab.2结果可见两种方法测定头孢唑肟钠的有关物质无显著性差异，本法可用于头孢唑肟钠中有关物质检查的定量测定。

    (2)方法的专属性考察显示，头孢唑肟钠对光和热较稳定，破坏后，杂质峰面积无明显增加；酸性条件下，主要杂质A、B峰面积变化不明显，但在保留时间约为2min处出现一个较大的未知杂质峰，主峰面积明显下降，提示检验过程容量瓶必须清洗干净，残留的清洗液对测定结果影响较大；碱性条件下不稳定，除主要杂质A、B峰外，还有未知降解产物峰，能较好反映头孢唑肟钠有关物质及降解的情况，同时相对保留时间约为0.94的杂质A峰与头孢唑肟峰的分离度可达2.5以上，故选择碱破坏溶液作为方法的系统适用性溶液。头孢唑肟钠经酸、碱、加热、光照等破坏，所产生的杂质峰与主成分峰均能达到有效分离，表明方法的专属强。

    (3)方法的耐用性考察中选用的4种色谱柱，无论是已知杂质峰或未知降解产物峰与主成分峰均能达到有效分离，且各峰的出峰顺序相同，表明该法对色谱柱的选择性无特殊要求。

    (4)在测定供试品的有关物质时，空白溶剂对测定无干扰，供试品溶液应配制后立即进样。

【】
  ［1］ Wu Y F, Ma Z S, Zhao X Y, et al. Clinical study of ceftizoxime sodium in the treatment of acute bacterial of respiratory system infection ［J］. J Jilin Med(吉林医学),2005,26(8):791

［2］ Liu X M, Yu S H, Huo J M, et al. Clinical efficacy and safety of ceftizoxime sodium in the treatment of acute moderate and severe bacterial infection ［J］. J Chin Cit Med(急救医学),2003,23(9):651

［3］ United States Pharmacopeial Convention, Inc. The United States Pharmacopeia ［S］. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, Inc.,2006:437

［4］ Society of Japanese Pharmacopoeia. The Japanese Pharmacopoeia［S］. Tokyo: Society of Japanese Pharmacopoeia,2001:345

［5］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)［S］. 北京：化学出版社，2005：附录VD28