流式细胞术CD45/SSC设门在急性白血病免疫分型中的应用

                     作者：张玮，程小丽，杨玉琮，陈葳，王翔，周萍，尤元义

【摘要】  目的 探讨流式细胞术CD45/SSC设门在急性白血病免疫分型中的应用。方法 选用三色荧光抗体直接标记初诊急性白血病患者骨髓，应用流式细胞术CD45/SSC设门进行免疫分型。结果 49例急性白血病患者分为三型，其中系列专一型25例，占51.2%；系列非专一型21例，占42.8%；裸型3例，占6.0%。结论 流式细胞术CD45/SSC设门，容易将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞群区分开，使白血病分型结果更准确、可靠。

【关键词】  流式细胞术；CD45；急性白血病；免疫分型

　　Application of CD45/SSC gating in acute leukemia immunophenotyping

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the application of CD45/SSC gating in acute leukemia immunophenotype. Methods  Three?color monoclonal antibodies were used to mark the marrows of acute leukemia patients, and CD45/SSC gating in flow cytometry was used for immunofluorescence. Results  The 49 cases of acute leukemia immunophenotype were classified into 3 subgroups: lineage specific antigen expression (25 cases), aberration antigen expression (21 cases), and null type (3 cases). The percentage of each subgroup was 51.2%, 42.8% and 6.0%, respectively. Conclusion  CD45/SSC gating technique can easily discriminate mature leukemia cells from normal cells, thus rendering more reliable and precise immunophenotype results.

　　KEY WORDS: flow cytometry; CD45; acute leukemia; immunophenotype

　　应用流式细胞术CD45/SSC设门进行急性白血病免疫分型已成为诊断急性白血病免疫分型的重要工具。传统的FSC/SSC设门分析最大缺点是不能将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞群完全分开。现今国际上多采用CD45/SSC设门，利用造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高度相关性，很容易将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞群完全分开，大大增加了白血病免疫分型的准确性。我院从2001年开始使用该方法，现将近几年内来自本院和外院的初诊49例急性白血病患者的免疫分型结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  病例选择  按照[1]的标准，49例来自本院和外院初诊的急性白血病患者经会诊而确诊。其中男30例，女19例，年龄1-80岁。

　　1.2  仪器和试剂  仪器为美国Beckman?Coulter公司EPICE ELITE型流式细胞仪，氩离子激光光源，功率15W，激发波长488nm，发射波长525nm。选用三色直接标记的荧光抗体，抗体组合根据阴性对照不同分为两种，以IgG1?FITC/IgG1?PE/CY5?CD45为阴性对照的抗体组合：CD10?FITC/CD13?PE/CY5?CD45、CD38?FITC/CD33?PE/CY5?CD45、CD34?FITC/CD19?PE/CY5?CD45、HLA?DR?FITC/CY5?CD45；以IgG2a?FITC/IgG2a?PE/CY5?CD45为阴性对照的抗体组合：CD20?FITC/ CD7?PE/ CY5?CD45、CD2?FITC/CD14?PE/CY5?CD45。上述抗体均购自Immunotech公司。

　　1.3  方法  采用单克隆抗体三色荧光直接标记法。取肝素抗凝骨髓2-3mL，常规溶血，将细胞数调整后溶于PBS中，每管加此样品100μL(约含1×106/mL)，加入荧光抗体20μL，混匀后置室温暗处20min，PBS洗涤，甲醛PBS固定后上机检测。

　　1.4  流式细胞仪检测  每次检测样本前用Flow check进行光路和流路的校正、调整荧光补偿，使变异系数在2%以内。每次计数>104个细胞，荧光阳性判断按CD34抗体阳性细胞≥10%，其他抗体阳性细胞≥20%为标准。

　　2  结果
   
　　对比FSC/SSC和CD45/SSC细胞点状图上设门分析，FSC/SSC设门时，分群模糊，只能看到一群细胞；CD45/SSC设门能将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞明显区分开。图1、图2为一名诊断为M1的急性白血病患者FSC/SSC(图1)和CD45/SSC(图2)细胞点状图。

　　图1  FSC/SSC设门，分群模糊，只能看到一群细胞（略）

　　Fig.1 FSC /SSC gating technique, Hive off was illegible. Only a group of cells were found

　　图2  CD45/SSC设门能将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞明显区分开（略）

　　Fig.2 CD45/SSC gating technique could easily discriminate the mature leukemia cells from normal cells
   
　　采用CD45/SSC设门，三色荧光抗体直接标记法，将49例急性白血病患者分为三型：系列专一型25例，占51.2%，其中髓系表型(M)19例、B淋巴细胞表型(B)5例、T淋巴细胞表型(T)1例；系列非专一型21例，占42.8%，其中T淋巴细胞表型/髓系表型(T/M)6例、B淋巴细胞表型/髓系表型(B/M)10例、T淋巴细胞表型/B淋巴细胞表型/(T/B)2例、T淋巴细胞表型/B淋巴细胞表型/髓系表型(T/B/M)3例；裸型3例，占6.0%(表1)。

　　表1  49例急性白血病患者的免疫分型（略）

　　Table 1  49 cases of acute leukemia immunophenotype

　　3  讨论
   
　　急性白血病是一类常见的造血系统肿瘤。骨髓中的原始/幼稚细胞无限制地增殖，且分泌成熟受阻，导致白血病细胞迅速累积，引起正常造血功能的抑制和衰竭。白血病方法很多，主要取决于白血病的类型，因此对白血病进行正确的分型至关重要。采用传统的FSC/SSC设门，部分原始/幼稚细胞被正常的淋巴细胞和单核细胞覆盖，使原始/幼稚细胞比例偏高，易出现假阳性或假阴性结果。现今国际上多采用CD45/SSC设门。CD45是人白细胞共同抗原，原始/幼稚细胞表达量比正常成熟细胞低，幼红细胞有少量表达，可特异地分析原始/幼稚细胞的免疫表型而不受正常成熟细胞的干扰。在CD45/SSC细胞点状图上，可根据不同细胞CD45表达的荧光强度和细胞内颗粒的密度将原始/幼稚细胞(低荧光强度，低或高SSC)、淋巴细胞(高荧光强度，低SSC)、单核细胞(高荧光强度，中等SSC)、中性粒细胞(低荧光强度，高SSC)、有核红细胞(极低荧光强度，低或高SSC)和细胞碎片(最低荧光强度，最低SSC)区分开[2?5]，经过对各群逐一分析，确立原始/幼稚细胞群，通过二维表型图谱，分析其抗原表达情况。原始/幼稚细胞少时，在CD45/SSC细胞点状图上能清晰显示[6]。
   
　　本室选用多种荧光抗体包括T淋巴细胞(CD2、CD7)、B淋巴细胞(CD10、CD19、CD20)、髓系细胞(CD13、CD33)、系列非特异性(CD34、CD38、HLA?DR)，均为白血病首选抗体。多种荧光抗体同时应用，更有利于白血病全面、可靠的诊断。本组49例急性白血病患者的免疫表型，①系列专一型：髓系表型(M)中CD13强表达占17/19、CD33强表达占17/19，两者无差异；B淋巴细胞表型(B)中CD19强表达占5/5；T淋巴细胞表型(T)中CD7强表达占1/1；②系列非专一型：T/M中CD7强表达占6/6；B/M中CD13、CD33、CD19、CD34、CD38均强表达占9/10；T/B中CD20、CD7、CD38均强表达占2/2；T/B/M中CD19、CD7、CD38均强表达占3/3；③裸型：无系列特异性抗原表达。由于抗原的系列特异性不是绝对的，在白血病细胞膜上，抗原的交叉表达或缺失现象很常见，已发现越来越多共表达，即某一细胞系列的急性白血病共表达另一细胞系列抗原[7]。本研究中系列非专一型共表达频率较高的抗原有CD7、CD19、CD13、CD33、CD34、CD38。其意义还有待于进一步研究。已有一些研究表明，CD7和CD34共表达在AML中预示着预后较差[7]。
   
　　通过选用三色荧光抗体，直接标记初诊急性白血病患者骨髓，应用流式细胞术CD45/SSC设门进行免疫分型，确保设门圈定原始/幼稚细胞群。本方法重复性好，客观准确，为白血病免疫表型分析的可靠性提供了保证。

【】
  　　[1]张之南，沈悌. 血液病诊断及疗效标准 [M]. 第二版. 北京：技术出版社, 1998:258.

　　[2]巩文玉． 流式细胞术白血病免疫分型中CD4设门的重要性 [J]. 临床检验杂志, 2002, 20(4):210.

　　[3]吴铭，金鸽，陈晓琳，等. CD45设门与FSC设门在急性白血病免疫分型的比较 [J]. 广东医学, 2004, 25(6):658?659.

　　[4]翟志敏，朱薇波，蔡晓燕，等. CD45单抗在急性白血病免疫分型中的作用 [J]. 白血病·淋巴瘤, 2002, 11(1):15?17.

　　[5]邹典斌，郭荣，张秋莹，等. 流式细胞术在人急性白血病免疫分型中的应用 [J]. 河南医科大学学报, 2001, 36(1):56?58.

　　[6]陈珊珊. 流式细胞术白血病免疫分型规范化 [J]. 实验血液学杂志, 2002, 10(1):1?5.

　　[7]苏杭，吴晓蔓． 三色流式细胞术在急性白血病免疫分型中的临床应用 [J]． 广东医学，2004, 25(9):1034?1036.