自配试剂免疫透射比浊比率法测定血清CIC
来源：岁月联盟
时间：2010-07-14
【关键词】 免疫透射比浊法 比率法 循环免疫复合物
Serum CIC Determination By Immunological Transmission Turbidimetry Ratio with Self?mix Reagents
Abstract: Objective To look for a new full?automatic instrumental method for Circulating Immune Complexes （CIC） determination,to replace the tedious handicraft labor of traditional method and gain more accurate results.Methods Try to mix BBS and PEG reagents self,establish the best procedure parameters with Kangning 560 combine with AU560,immunological transmission turbidimetry 4 points calibration the PEG and BBS,compute the CIC value with ratio method,then judge its accuracy and degree of precision by percentage recovery ratio study and repeatability study,make contrast experiment to compare with traditional PEG precipitation method. Results The best procedure parameters of CIC instrumental method were:Serum:Reagents=1:8,λ1340 nm,λ 2450 nm,endogenous read time 20 Sec,total reaction time 288 Sec,total reaction volume 180 ul,37 ℃. Percentage recovery ratio,inside day and daytime percentage variation coefficient(CV%) of this method and traditional PEG precipitation method respectively for 97% ～110%,3.5%,4.3% and 90 %～122%,6.8%,9.7%. Compared with traditional PEG precipitation method,it has no difference in accuracy（P＞0.05），the two have good correlation（r=0.852）,but degree of precision is higher than handicraft method.Conclusion Serum CIC determination by immunological transmission turbidimetry ratio with Self?mix reagent,its operation is simple and convenient,also it shows quantitative measurement relatively accurate,good repeatability,wide linear,it may replace nitty?gritty traditional hand?operation completely.
Key Words： Immunological transmission turbidimetry； Ratio； Circulating Immune Complexes
检测血清循环免疫复合物（CIC）传统的方法是PEG沉淀法，该方法需4℃冰箱1 h，室温45 min，而后以BBS管调零 λ500 nm测PEG管，查标准曲线得出结果［1］。整个操作过程均为繁琐的手工劳动，其定量结果也略显粗糙。将CIC检测搬上全自动仪器，是一个亟待解决的课题。近年来，随着大型全自动生化仪的逐渐普及，以仪测代替手工劳动已成为检验界一个大趋势。免疫透射比浊法更以其简捷、灵敏、准确、重现性好和易于在全自动化仪器上进行大批量检测的优点更多地为人们所采用。我们利用自配试剂在康宁560全自动生化仪上建立了CIC测定，使CIC繁琐的传统检测变得简单易行，保证了准确性，提高了精密度，获得较满意的结果。
1 材料和方法
1.1 试剂
BBS试剂：硼砂（Na2B4O7·10H2O）AR 8.59g，硼酸AR 6.82g，加水至1 000 ml；PEG试剂：用聚乙二醇（AR）4.167 g加BBS试剂至1 000 ml，NaN3防腐。
1.2 CIC定值血清
鉴于目前国内市场未见有CIC定值血清出售，自制混合血清，以传统PEG沉淀法重复测定20次，统计结果，以(±s)表示，其中X作为定值血清靶值。本实验中，定值血清为(291.0±14.0)U，以生理盐水配制成4点定标系列（0，72.8，145.5，291.0 ）。
1.3 仪器
康宁560（美国）为测试仪器；Au560（日本）辅助设置参数。
1.4 测定方法及参数选定
康宁560结合Au560 选定CIC检测的最佳设置参数，而后以CIC定值血清作四点定标，免疫透射比浊终点法测定PEG、BBS，计算各自直线回归方程和相关系数r，比率法（Ratio）计算CIC。CIC=PEG－BBS，单位为U。
1.5 回收试验
任选15份待测患者血清，随机加入高中低值CIC定值血清（291.0、145.5、72.8），分别作加入前后的本法和传统PEG沉淀法CIC检测，计算两者回收率。
1.6 重复性试验
将上述15份血清分别作本法和传统PEG沉淀的日内、日间重复性测定（n=5），计算各自日内、日间变异系数（CV%）。
1.7 对比试验
两法双份平行测定，统计其相关性。
2 结果
2.1 参数设置结果
血清∶试剂＝1∶8，总反应体积为180 μl，λ1 340 nm，λ2 450 nm，内源性读数20 Sce，反应温度37℃。Au560检测血清CIC的时间反应浓度监测曲线，见图1。
2.2 标准曲线
以定值血清四点（0，72.8，145.5，291.0）重复三次定标，以［该点CIC靶值/(ODPEG－OD)］×ODPEG为该点PEG靶值,以 (PEG－CIC)为该点BBS靶值,得出康宁560 PEG、BBS、CIC标准曲线，直线回归方程分别为YPEG=16.24+545.485X，直线相关系数γ=0.924 ；YBBS=8.10+239.262X，直线相关系数r=0.810；YCIC=8.14+306.223X，直线相关系数γ=0.916。按照康宁560吸光度线性范围，则本法检测CIC的浓度线性范围为0 U～623 U。
2.3 本法与传统PEG沉淀法的准确性、精密度比较及相关性分析结果
见表1。表1 本法与传统PEG沉淀法比较（略）注：统计学方法为配对资料χ2检验。
3 讨论
本法的参数设置中，样品试剂比及主次波长的选择经过一系列探索性试验而选定。免疫透射比浊法中总体反应时间的选定是一个很关键的问题，反应时间过短，会造成方法灵敏度和检测限的下降，反应时间过长则易导致带现象的发生。本法的建立过程中，利用Au560 CIC检测的时间反应浓度监测曲线可以看出，从反应开始至第8读数点，反应浓度（浊度）随时间上升很明显，为最大斜率，第8点后则趋于平缓，斜率逐渐降低，所以总体反应时间设置为第8读数点（36×8=288 Sec），确保方法具有较高的灵敏度。
本法检测的原理是建立在传统PEG沉淀的基础上，限于康宇560仪器本身的缺陷，笔者将其设为比率法，即分别定标PEG和BBS两种标准曲线，设定CIC=PEG－BBS。从得到的直线回归方程及相关系数来看，结果令人满意。
从表1可以看出：本法与传统PEG沉淀法准确性差异无显著性（P＞0.05），理论上仪测方法由于其加样量精确、波长漂移小，读数时间准等特点应该有更好的准确性，本研究中两者差别不明显，可能是由于缺乏商品CIC定值血清，而自制混合血清又是通过传统PEG沉淀法来确认靶值，造成了两者间的循环认证；两法日间和日内精密度有明显差别，本法明显高于传统PEG沉淀法（P＜0.05），这也是仪器检测方法本身所显示的优越性之一。通过对15份血清标本的双法平行测定，两法具有较好的相关性（γ=0.852）。
综上所述，建立免疫透射比浊比率法检测血清中CIC，从方法的灵敏度、准确性、重现性、线性范围及操作简便等方面而言是切实可行的，并且有其独特的优越性，完全可以取代传统的手工操作方法。
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［1］叶应妩.全国临床检验操作规程［M］.第二版.南京：东南大学出版社，1997:372.
