弓形虫p30?Rop2复合基因大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒的构建
【摘要】 目的：构建弓形虫p30?Rop2复合基因大肠杆菌/分枝杆菌穿梭表达质粒。方法：利用PCR技术从已构建的pET30?p30?Rop2质粒扩增p30?Rop2复合基因片段，亚克隆于大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3?p30?Rop2，并进行双酶切鉴定和测序分析。结果：成功构建pSTM3?p30?Rop2重组穿梭表达载体，测序结果发现有一个碱基发生突变，但没有改变开放阅读框。结论：pSTM3?p30?Rop2穿梭质粒的成功构建为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件。
【关键词】 弓形虫;p30?Rop2复合基因；穿梭表达载体
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种世界性分布的专性胞内寄生原虫，能引起人兽共患的弓形虫病。全世界约有1/3的成年人感染弓形虫，但多为隐性感染。我国人群的感染率约在5％～20％，平均为8.5%。孕妇感染弓形虫后，常可通过胎盘将弓形虫传给胎儿，可导致流产、畸胎、死胎等，而在AIDS患者等免疫功能严重受损者，弓形虫是引发致死性病变的主要病原之一［1］。由于弓形虫寄生生活的复杂性、形态的多变性，仅利用某一时期、某一形态的单一抗原制备的单价疫苗，远远不能激发全方位的宿主抗寄生虫免疫反应，难以达到理想的抗虫目的。 本研究将弓形虫主要表面抗原p30和棒状体蛋白Rop2候选抗原基因克隆到大肠埃希菌?分枝杆菌穿梭表达载体pSTM3中，构建重组pSTM3?p30?Rop2质粒，为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌株 重组克隆质粒pET30?p30? Rop2、穿梭表达质粒pSTM3和大肠杆菌DH5α均为本单位实验室保存。
1.1.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶、dNTP、Hind III、T4DNA连接酶,均为Promega公司；DNA纯化试剂盒（QIAquick）,质粒抽提试剂盒（QIA prep Spin Miniprep kit）均为QIAGEN公司产品。EcoRⅤ 为Fermentas公司产品；TOPO克隆试剂盒为Invitrogen公司产品。
1.1.3 引物的设计与合成 根据GenBank提供的序列，分别设计p30基因的上引物和Rop2基因的下引物。在上引物5′端引入EcoRⅤ酶切位点，下引物3′引入HindⅢ酶切位点，并分别在NCBI进行BLASTEN查看引物的特异性，并用Oligo软件进行评分,引物序列为：
P1 5'?ACGATATCAAGGAGATATACCATGTTCACTC
TCAAGTGCC?3';
P2 5'?ATAAGCTTTCATGCCGGTTCTCCATCAG?3'，由上海生工生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 目的基因p30?Rop2的PCR扩增 提取pET30?p30?Rop2质粒，作为模板，反应条件：预变性94℃ 2 min；94 1 min；55℃ 45 s，72℃ 3 min，30个循环；最后延伸72℃ 15 min。扩增产物约为1 900 bp，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.2 扩增片段的TOPO?TA克隆和测序 将PCR产物进行跑胶回收后，建立6 μl连接体系：PCR产物3 μl、salt solution 2 μl、TOPO vector 1 μl,16℃ 4 h,将连接产物全量转化200 μl DH5α感受态，PCR法鉴定阳性重组子，并提取质粒酶切鉴定后送公司测序。
1.2.3 穿梭表达载体pSTM3?p30?Rop2的构建 将TOPO?p30?Rop2质粒和pSTM3空质粒同时双酶切，回收目的基因片段和载体大片段。建立如下连接体系：目的基因6 μl、载体大片段2 μl、T4DNA连接酶1 μl、Buffer 1 μl；16℃ 3 h。将连接产物全量转化200 μl DH5α感受态，PCR法鉴定阳性重组子，并提取质粒酶切鉴定。
2 结果
2.1 目的基因的体外扩增 p30?Rop2复合基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,约在1 900 bp处见到明显的扩增产物条带,未见非特异扩增条带,与理论扩增产物长度吻合(图1)。
2.2 TOPO?TA克隆载体的鉴定 提取PCR阳性菌提取质粒后用EcoRⅤ和HindIII双酶切，得到的基因片段大小与预测值一致。测序结果与GenBank报道的序列进行比对后发现有三个碱基发生突变，其中两个不改变氨基酸的性质，Rop2基因的174位氨基酸密码子由CCT突变为CTT，编码氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，见图2。
2.3 重组质粒pSTM3?p30?Rop2的酶切鉴定 提取筛选到的pSTM3?p30?Rop2质粒，分别进行EcoRⅤ+HindⅢ双酶切及EcoRⅤ+HindⅢ+EcoRⅠ三酶切和PCR扩增，双酶切可见大小约1 900 bp和5 000 bp的两条带，三酶切后可产生1 100 bp、750 bp和5 000 bp三条带，大小与目的DNA和载体片段长度相符，PCR扩增可获得与预期相符、大小约1 900 bp的单一条带，表明p30?Rop2复合基因已克隆到pSTM3载体中。
3 讨论
p30蛋白是弓形虫速殖子表面主要抗原，基因全长1 634 bp，是单一拷贝基因，不含有内含子，其编码区序列（CDS）从311?1321，其中311?541编码信号肽序列［2］。p30在弓形虫入侵宿主细胞时起重要作用，是一种重要的疫苗侯选抗原，p30亚单位疫苗和核酸疫苗的研究多有报道，均可以产生一定的免疫保护性［3］，但由于其表达具有特异性，只能在速殖子阶段表达，所以不能产生针对弓形虫各个阶段的特异性抗体。Rop2是弓形虫棒状体分泌的一种蛋白，定位于纳虫泡表面，其氨基端暴露与宿主细胞胞质侧，主要介导纳虫泡与宿主细胞线粒体和内质网接触，在弓形虫生活的各个阶段均有表达。pSTM3是大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒该质粒可以在大肠杆菌和分枝杆菌中复制并可以在分枝杆菌表达外源蛋白［4］。外源蛋白的表达受控于Hsp 60启动子，该启动子来源于BCG热休克蛋白Hsp 60，当受到热或者应急刺激时会启动下游基因的转录，并且体外实验已证明该启动子可以在小鼠巨噬细胞内诱导目的基因的转录和表达［5］。本研究选用p30基因的部分序列，去掉了N末端的信号肽和C末端的疏水性尾巴和Rop2部分序列，包括三个T细胞表位197?216，393?410，501?524［6］。经PCR扩增的目的基因测序后发现Rop2基因有一个碱基的突变改变了氨基酸的性质，但这个突变是扩增质粒模板已经存在的，且不在三个T细胞表位内，已有实验证明该突变不影响重组蛋白的免疫反应性。本研究将截短的p30基因和Rop2基因联合重组于pSTM3大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒，为下一步构建弓形虫分枝杆菌疫苗打下了基础。
【】
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